[发明专利]一种T2毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种T2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和用途，属食品安全检测领域。

背景技术

毒素是由多种真菌，主要是三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物(trichothecenes，TS)之一。它广泛分布于自然界，是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害较大。T-2毒素为白色针状结晶，在室温条件下相当稳定，放置6~7年或加热至100~120℃ 1小时毒性不减。T-2毒素带有酯基，用碱处理后水解成相应的醇。要使双键还原可用接触氢化。四氢钾铝或氢硼化钠可使环氧基还原成醇。

毒素主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴结、生殖腺及胃肠粘膜等，抑制这些器官细胞蛋白质和DNA合成。此外，还发现该毒素可引起淋巴细胞中DNA单链的断裂。T-2毒素还可作用于氧化磷酸化的多个部位而引起线粒体呼吸抑制。1973年联合国粮农组织(FAQ)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席会议上，把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在的最危险的食品污染源。我国国标GB 21693-2008规定，饲料中的T2毒素含量不能超过1000ug/kg。

目前T2毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。

其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测T2毒素的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作,且成本低,无需价格昂贵的仪器,。但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量,主观影响较大,灵敏度不高等,已远远不能满足现代检测要求。

酶联免疫吸附试验（ELISA ）检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。成本低的特点,适用于基层机构大量样品的筛选和普查,可以大大节省时间和费用,因此越来越受到基层检验单位的欢迎。ELISA方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于基层的筛查检测。

高效液相色谱法( HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点,是目前常用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高,导致检测成本高、周期长,无法满足大批量样品快速筛选的需要,所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱（IAC-HPLC)）将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术,在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时,其中的抗原与抗体结合,其他杂质则通过水溶液洗掉,再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来,从而使样品中的毒素得以净化。

免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。

适配体是一段核酸序列，通常为DNA或者RNA序列。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。Herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[Science 287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸适配体被应用于小分子的检测，在专利CN103808701 A中描述了一种基于赭曲霉毒素的核酸适配体荧光嵌合染料检测赭曲霉毒素的方法，利用赭曲霉毒素的核酸适配体与互补序列形成一个检测元件，利用嵌合染料作为报告分子检测样本中的赭曲霉毒素。在专利CN102735704A中，描绘了一种赭曲霉毒素的电化学传感器，利用赭曲霉毒素的适配体包被在裸金电极上，制备电化学传感器，用于检测赭曲霉毒素。在专利CN105372213A中，描述了一种利用赭曲霉毒素适配体检测方法，将赭曲霉毒素的适配体用上转发光材料标记，利用上转发光材料的荧光能量转移特性进行检测。

基于核酸适配体的检测方法很多，但是净化和纯化方法较少。在专利CN104399283中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素B1的适配体偶联，制备成亲和柱。实现黄曲霉毒素的分离。

发明内容