[发明专利]一种人血清中非Gal异种抗体检测方法

说明书

本发明公开了一种人血清中非Gal异种抗体检测方法，用于猪器官移植到人体的异种器官移植中受体人中抗供体猪非Gal抗原的抗体的检测，所述方法包括：按照10⁵个细胞与100μL人血清的比例，使αGal敲除的基因敲除猪的外周血单核细胞与人血清混合孵育3小时检测IgM，孵育6小时检测IgG。本发明的人血清中非Gal异种抗体检测方法，提高流式检测非Gal抗原结合人异种抗体的灵敏性、准确性和可重复性，有助于筛选非Gal表达抗原低表达的供体猪。

技术领域

本发明涉及异种器官移植技术领域，尤其涉及一种人血清中非Gal异种抗体检测方法，用于猪器官移植到人体的异种器官移植中受体人中抗供体猪非Gal抗原的抗体的检测。

背景技术

器官短缺是制约临床大规模开展器官移植手术的重要瓶颈。使用猪的器官作为替代，是解决这一难题的潜在方案[1]。包括人在内的灵长类动物的血清中存在针对猪蛋白的天然抗体，可以识别猪细胞上的异种抗原，介导了对异种移植物的排斥，引发超急性排斥反应。人血清中识别猪抗原的异种抗体主要目标是αGal，人体内循环的IgG中约1％是抗αGal抗原的。GTKO猪的出现缓解了由αGal引发的超急性排斥反应，延长了移植物的存活时间。

敲除αGal抗原并不能完全避免超急性排斥，原因之一是还存在其它的异种抗原能够被灵长类动物血清中的天然异种抗体所识别，例如Neu5GC和Sd^a抗原。因此，检测移植受体内抗非Gal抗原抗体的水平是非常重要的，可能会影响异种器官的存活时间。已有的异种移植研究中，利用猪的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)检测血清中的异种抗体水平是很常用的方法，一般采用4℃孵育30分钟。这一方法对于抗αGal抗体是足够灵敏的。这是由于人血清中含有大量的抗αGal抗体，而抗非Gal抗体的丰度远远低于抗αGal抗体，因此在测定非Gal抗原水平时有必要提高检测方法的灵敏度，并细化检测方法。目前针对非Gal抗原检测，还没有一个统一的标准，不同实验间也无法作比较。

发明内容

本发明提供一种人血清中非Gal异种抗体检测方法，提高流式检测非Gal抗原结合人异种抗体的灵敏性、准确性和可重复性。

一种人血清中非Gal异种抗体检测方法，用于猪器官移植到人体的异种器官移植中受体人中抗供体猪非Gal抗原的抗体的检测，上述方法包括：按照10⁵个细胞与100μL人血清的比例，使αGal敲除的基因敲除猪的外周血单核细胞与人血清混合孵育3小时检测IgM，孵育6小时检测IgG。

进一步地，上述αGal敲除的基因敲除猪是GGTA1敲除的基因敲除猪。

进一步地，上述αGal敲除的基因敲除猪是GGTA1敲除的五指山猪。

进一步地，上述人血清是混合的健康人血清。使用混合的健康人血清，能够消除由个别血清带来的检测结果的偶然性。

进一步地，上述孵育在4℃下进行。

进一步地，上述孵育后，使用异种血清封闭，然后使用抗人的荧光标记的抗体孵育，再使用流式细胞仪检测外周血单核细胞上结合的IgM和/或IgG的水平。

进一步地，上述异种血清是灭活的山羊血清。

进一步地，上述抗人的荧光标记的抗体是异硫氰酸荧光素标记的山羊抗人IgG或IgM。

进一步地，上述使用异种血清封闭是在4℃封闭20分钟。

进一步地，上述使用抗人的荧光标记的抗体孵育是在4℃避光孵育30分钟。

本发明的人血清中非Gal异种抗体检测方法，提高流式检测非Gal抗原结合人异种抗体的灵敏性、准确性和可重复性，有助于筛选非Gal表达抗原低表达的供体猪。

附图说明