[发明专利]一种免疫磁珠法分离胎盘滋养层细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫磁珠法的细胞分选技术，具体涉及一种免疫磁珠法分离胎盘滋养层细胞的方法。

背景技术

滋养层细胞是在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化并沿透明带内壁扩展和排列的较小个体细胞，将来发育成胎膜和胎盘。早期就有研究表明，孕妇宫颈脱落细胞中存在胎盘滋养层细胞，贯穿整个孕期。因此，对滋养层细胞实现有效分离并获取胎儿DNA，对于最早期的产前筛查和诊断具有重大意义。

许多研究表明，在早孕期包蜕膜和真蜕膜尚未融合时，一定比例的滋养细胞会穿过包蜕膜到达子宫腔，部分脱落到子宫下段，或者通过绒毛退化并脱落至子宫下段或宫颈处，并逐渐积聚，所以若使用一种微创或无创的方法采集宫颈处细胞，就可以精确地进行胎儿的产前诊断，这无疑是一种极具吸引力的方法。

免疫磁珠法细胞分选技术是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。细胞分选的方法包括直接法和间接法，直接法即抗体直接与细胞表面抗原结合，间接法即抗体(二抗)通过其本身的抗原(一抗)与细胞表面的抗原结合。

人白细胞抗原-G(HLA-G)基因是位于6号染色体短臂的一类免疫耐受分子，具有选择性组织分布的特点，HLA-G分子主要在人胎盘组织中转录，表达于孕卵着床期母体子宫内膜的胎盘组织中，通常情况下，HLA-G可作为孕期胎儿滋养层细胞的特异性标志物。

当前胎儿滋养层细胞的分离纯化方案主要有以下几类：1)组织块培养法，根据不同类型细胞的培养悬浮/贴壁状态不同实现对滋养层细胞的分离。取样后制备成单细胞悬液进行培养，血细胞和Hofbauer细胞为非贴壁，换液过程容易去除；成纤维细胞和滋养层细胞为贴壁，但成纤维细胞贴壁速度较快且对胰蛋白酶敏感，可在消化过程中分离。此方法得到的滋养层细胞纯度约为80％，成功率在90％左右。2)密度梯度离心法，采用不连续或连续的溶液梯度对细胞进行分离，确定滋养层细胞所处的密度层从而完成分离。可分为Percoll法、淋巴细胞分层液法、Ficoll法。此方法分离的细胞形态完整、活性较好，纯度可从80％～90％以上，与分层液的类型关系较大。然而，这些方案虽然能够取得较好的分离效果，但这些方法均存在操作过于繁琐，分离时间过长等缺点，严重限制滋养层细胞在胎儿产前筛查领域的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫磁珠法分离胎盘滋养层细胞的方法，该方法基于免疫磁珠法细胞分选技术，利用抗体偶联磁珠实现对胎盘滋养层细胞的特异性捕获，简单的几步孵育便能轻松、快速的实现滋养层细胞的分离，且易于实现自动化，有效解决了传统方法存在的繁琐、低效和时间过长等问题。

为达上述目的，本发明的主要技术解决手段是提供一种免疫磁珠法分离胎盘滋养层细胞的方法，包括以下步骤：

(1)免疫磁珠偶联特异性抗体的制备，向免疫磁珠中加偶联剂和能够特异性捕获胎盘滋养层细胞的抗体进行孵育；

(2)洗涤(1)中孵育完成的偶联抗体的免疫磁珠2次，将偶联抗体的免疫磁珠保存在保存液中备用；

(3)收集胎盘滋养层样本，采用酶解法将该样本制备为样本细胞悬液；

(4)把(3)中的样本细胞悬液洗涤2次；

(5)向(4)洗涤后的样本细胞悬液中加入(2)中的偶联有特异性抗体的免疫磁珠进行孵育；

(6)洗涤孵育完成的(5)中的免疫磁珠2次，弃上清，即可得到纯化的胎盘滋养层细胞；

优选的，所述免疫磁珠为羧基磁珠、环氧基磁珠、甲苯磺酰基磁珠，更优选的，所述免疫磁珠为甲苯磺酰基磁珠，优选供应商为Thermo fisherM-270 Epoxy(货号14301)，所述偶联剂为与免疫磁珠类型相对应的偶联剂，偶联方法与所购免疫磁珠类型相一致。

优选的，能够特异性捕获胎盘滋养层细胞的抗体为HLA-G抗体，所述步骤(1)孵育的条件和时间与所购免疫磁珠类型相一致，优选的，孵育条件为37℃偶联16-24h，更优选的，孵育条件为37℃偶联24h。

所述步骤(2)、(4)和(6)的洗涤液均为细胞培养用PBS，优选的，PBS构成组分为1.35M NaCl，47mM KCl，100mM Na₂HPO₄，20mM NaH₂PO₄，且PBS的pH值为7.4。