[发明专利]高香草酸均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测试剂领域，具体涉及一种高香草酸均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法。

背景技术

高香草酸(Homovanilic acid，HVA)，其结构式如式(Ⅱ)所示：

高香草酸(Homovanilic acid，HVA)是儿茶酚胺最主要的终末代谢产物之一，测定尿液中高香草酸含量主要用于评价体内儿茶酚胺的代谢水平，从而对与其相关的某些神经系统疾病做出诊断。准确、高效地测定尿液中高香草酸的含量，对神经母细胞瘤、精神分裂症等神经系统疾病的诊断及病情监测都具有重要意义。有研究表明：机体长期接触金属锰会导致职业性锰中毒的发生，以帕金森症为典型的临床表现，尿液中高香草酸的含量可以用来评价机体锰中毒的情况。由于高香草酸在人尿液中的含量较低，且尿液基质非常复杂，因此对检测方法的灵敏度和特异性都提出了较高的要求。

目前，测定尿液中高香草酸的方法主要有酶荧光光度法、比色法、伏安法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱法、薄层色谱法以及电离子透入法等。但这些方法都较为费时费力，且检测成本较高，不适合大批量临床样品的测定。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的高香草酸检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的高香草酸测定试剂盒已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对高香草酸的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，能有效满足国内日益增长的临床检测需求。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的高香草酸制备免疫原性强的高香草酸免疫原及其抗体，用该抗体制备的高香草酸均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对高香草酸高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低高香草酸检测成本，有利于临床推广使用。

本发明的一个目的在于提供一种高香草酸均相酶免疫检测试剂，含有抗高香草酸特异性抗体和酶试剂，其特征在于：所述的酶试剂由高香草酸酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；

所述的抗高香草酸特异性抗体由高香草酸免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或

者为保留与高香草酸特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；

所述的高香草酸免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：

载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽。优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白，更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。

所述的高香草酸免疫原由高香草酸与上述载体连接而成，高香草酸的化学结构如式(Ⅱ)所示：

所述的高香草酸免疫原的制备步骤如下：

(1)将载体蛋白100～300g溶解于25～75mL 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；

(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg高香草酸、1.75～5.25mL二甲基甲酰胺、1.75～5.25mL乙醇、3.5～10.5mL 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、100～300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min；

(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到高香草酸免疫原。

一种抗高香草酸特异性抗体，由上述的高香草酸免疫原免疫实验动物后生产得到。

所述的抗高香草酸特异性抗体由上述制得的高香草酸免疫原采用常规方法接种实验动物，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：

(1)用PBS将上述合成的BSA-高香草酸免疫原稀释至0.1～3.0mg/mL，得到抗原溶液，然后用0.5～5.0mL抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；

(2)2～3周后，再用0.5～5.0mL相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3～6次；

(3)对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000～1:50000的抗高香草酸特异性抗体。

本发明的抗高香草酸特异性抗体为完整的抗体分子，也包括保留与高香草酸特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。