[发明专利]一种温度可控基于酶催化的电化学过氧化氢传感器

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种温度可控基于酶催化的电化学过氧化氢传感器。

背景技术

过氧化氢既是一种优良的氧化剂也是一种重要的化工产品，一般用做氧化剂、消毒剂，在日常生活、食品加工以及医药等领域有着广泛的应用。在许多酶促反应过程中，过氧化氢是其中间代谢产物，并与许多生物体内的新陈代谢过程相关联。由于很多细胞都可以产生过氧化氢，它的跨膜输运过程相对稳定，对许多生物过程具有重要的调节作用。然而，对绝大多数的生物来说，过氧化氢的含量如果过高就会对细胞产生毒害作用。过氧化氢对人们的日常生活、环境污染以及健康安全等均有重大影响，因此研究对过氧化氢进行快速、灵敏、准确的检测方法具有很大的意义。在现阶段，过氧化氢的检测方法主要有分光光度法、化学发光法、电化学方法以及色谱法。其中电化学分析方法，尤其是其中研究的最多的是基于各种过氧化物酶的生物传感器，因其成本低、操作比较简单、灵敏度较高及选择性高，受到了广泛关注。

辣根过氧化物酶是由铁原卟啉与糖蛋白结合而成的复合物，在自然界中的主要来源是辣根。辣根过氧化物酶性质较为稳定，具有特殊催化氧化性能。

辣根过氧化物酶是一种对温度变化十分敏感的蛋白质，当温度低于最适温度时，酶的活性较差，但当温度过高时，酶分子的结构极易发生不可逆转的变性，而导致酶的失活。以往报道的电流型过氧化氢生物传感器，多是控制实验体系的整体温度变化，所需装置复杂，操作不易；在热电极表面直接构建酶传感器，可以只改变电极表面的温度使酶处于最适条件而不对溶液进行整体加热，这样可以提高辣根过氧化物酶催化活性，使得催化反应更快更彻底的进行，从而使电极响应信号增大。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种温度可控基于酶催化的电化学过氧化氢传感器。本发明利用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与修饰在金丝热电极上的带有生物素的巯基化捕获探针特异性结合，将辣根过氧化为酶固定在电极表面，通过调控金丝热电极温度来提高辣根过氧化物酶催化活性，实现了对过氧化氢的高灵敏度检测。本发明的传感器结构简单、制备工艺简单、灵敏度高、检测限低、抗干扰性好。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种温度可控基于酶催化的电化学过氧化氢传感器的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）设计一条捕获探针DNA链，所述DNA链5’端巯基化，3’端标记了生物素；其中，捕获探针的DNA序列为：5’-HS-(CH₂)₆-TTTCG TTACT CCCTT CCTCC CCGCA CGGCC-biotin-3’；

（2）将金丝热电极打磨抛光成镜面，经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金丝热电极；

（3）将含有步骤（1）设计的3’端标记了生物素的巯基化捕获探针的缓冲液滴加在步骤（2）中处理好的金丝热电极上进行修饰；后用巯基己醇浸入电级，对电极表面残余位点进行封闭；再用牛血清蛋白浸入电级，对电极表面活性位点进一步封闭，得到捕获探针修饰的金丝热电极；

（4）在步骤（3）中得到的捕获探针修饰的金丝热电极表面滴加5μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，反应结束后得到电化学传感器。

步骤（2）中，金丝热电极的打磨在麂皮上并添加氧化铝粉末进行打磨；超声清洗的时间为40～60s，干燥为氮气吹干。

步骤（3）中，所述缓冲液为10mM PBS，其pH为7.2～7.6。

步骤（3）中，3’端标记了生物素的巯基化捕获探针浓度为1～2μM；修饰温度为37℃；修饰时间为1.5～2.5h；

步骤（3）中，巯基己醇浓度为0.1～4mM，电极浸入时间为1h；

步骤（3）中，牛血清蛋白浓度为0.1～2wt%，电极浸入时间为1h；

步骤（4）中，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素浓度为8～12 μg/ml，反应温度20～25℃，反应时间为0.2～1h。

本发明还提供了一种上述传感器在检测过氧化氢中的应用，检测过程如下：

将上述电化学传感器与银氯化银参与电极和铂丝对比电极构成三电极系统，在通氮除氧及加入1 mM 对苯酚和不同浓度的过氧化氢的缓冲液中进行循环伏安检测，得到的催化过氧化氢响应信号与过氧化氢浓度成线性关系，实现对过氧化氢灵敏检测；

上述步骤中，所述缓冲液为0.1M PBS，其pH为7.2～7.6。电化学检测过程中，通过调控电极温度来提高辣根过氧化物酶催化活性，促进催化过程更快更彻底的进行，实现了对过氧化氢的高灵敏度检测。