[发明专利]越橘植物种质的超低温保存方法

权利要求书

1.一种超低温保存越橘植物种质及恢复培养的方法，其特征在于，它包括：

1）炼苗：选取4周苗龄的组培苗，取0.4-0.6 cm带有顶芽的茎段接种到WPM培养基上4℃暗处理2—4周；

2）越橘茎尖剥取：在无菌条件下，在体视显微镜下剥取炼苗后的顶芽，茎尖长为1.5—2.0mm；

3）预培养：将剥取的茎尖接种于添加有0.3M蔗糖的WPM固体培养基上，于组培室黑暗培养18—30h；

4）装载：将预培养后的离体茎尖转接于装载液中，于室温下装载处理20-40min；

5）玻璃化处理：将装载处理后的茎尖转接于PVS2溶液中，于0℃处理30-50min；

6）小液滴制作：将PVS2处理后的茎尖转移到锡箔条上 ,并向每个茎尖滴加6μL PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2小液滴中，每个锡箔条上放9-11个茎尖；

7）超低温冷冻保存：将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻后的锡箔条置于冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮中保存；

步骤1) 所述的炼苗时间为3周，步骤3)所述的预培养时间为24h；

步骤4）中所述的装载液的组成为：WPM+2M甘油+1.0M蔗糖，装载时间为30min；

步骤5）所述的PVS2溶液的组成为：WPM+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4M蔗糖；处理时间为40min；

8）卸载：将步骤7）所述的超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于卸载液中进行解冻和卸载；所述的卸载液的组分为：WPM+1.2M蔗糖；卸载条件为：室温下卸载20min；

9）恢复培养：将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表面残留液，转接于恢复培养基中进行恢复培养；恢复培养基为WPM+0.3mg/L ZT +3％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8；恢复培养条件为：组培室黑暗培养 1d，最后转至正常光照条件下进行培养。