[发明专利]抗乙型肝炎病毒的递送系统和生物制剂

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及抗乙型肝炎病毒领域，更具体涉及一种新型的抗乙型肝炎病毒的新型递送系统和生物制剂。

背景技术

全球乙肝病毒感染者约有3.5亿人，其中约1亿人在中国。这些人由于乙肝病毒潜伏无法得到根治。乙肝病毒潜伏的主要原因是其基因组以一种共价闭环DNA(covalently closed circular DNA或cccDNA)的形式在病人的肝细胞核内长期稳定存在。现有的抗乙肝药物主要是干扰素和核苷(酸)类似物，但这两类药物均无法清除cccDNA，因而无法根治乙肝。

新兴的基因编辑技术CRISPR-Cas9系统由于其高效特异的DNA剪切和编辑能力而得到了在科研领域的广泛应用。CRISPR-Cas9是在细菌中发现的一种DNA剪切系统，通过DNA内切酶Cas9在一段小RNA(guide RNA)的帮助下识别特定的DNA序列并在特定的位点进行剪切。由于需要同时表达一个大的蛋白Cas9和一个小的guide RNA，如何在人体进行安全有效的输送有特异疗效的CRISPR-Cas9系统是一个亟待解决的问题，并已经成为CRISPR-Cas9在临床应用的瓶颈。

已有的CRISPR-Cas9体内输送是通过运用腺病毒表达体系来表达Cas9和guide RNA，但是腺病毒的安全性仍有问题。而且，腺病毒在细胞内的长期稳定表达Cas9这种DNA酶，也有可能带来长期的毒副作用。基于新型的脂质纳米颗粒(LNP)的核酸输送系统已经在活体内输送小RNA比如siRNA和长链RNA比如mRNA上表现出良好的效果。

因此，对于安全有效的输送有特异性疗效的CRISPR-Cas9系统仍存在需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的LNP递送系统，通过将LNP与Cas9mRNA和一段单链guide RNA(sgRNA)通过微流装置进行混合而得到，其能够有效的被输送到小鼠肝脏并对乙肝病毒cccDNA进行剪切，达到抑制乙肝病毒的目的。该试剂提供了一种在人体安全根治乙肝病毒的可能性。

本发明的第一个方面涉及靶向HBV基因保守区域的sgRNA分子，其具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10所示的核酸序列之一：GAGGTGAAGCGAAGTGCACA(SEQ ID NO:1)；CCACCCAAGGCACAGCTTGG(SEQ ID NO:2)；CGGGGAGTCCGCGTAAAGAG(SEQ ID NO:3)；AAGCCACCCAAGGCACAGCT(SEQ ID NO:4)；GAAGCGAAGTGCACACGGTC(SEQ ID NO:5)；AGAAGATGAGGCATAGCAGC(SEQ ID NO:6)；CAAGCCTCCAAGCTGTGCCT(SEQ ID NO:7)；GGGGCGCACCTCTCTTTACG(SEQ ID NO:8)；GGACTTCTCTCAATTTTCTA(SEQ ID NO:9)；或TCCTCTGCCGATCCATACTG(SEQ ID NO:10)。

本发明的第二个方面涉及用于将基于CRISPR-Cas9系统的RNA分子运输到肝脏的脂质纳米颗粒。该脂质纳米颗粒由脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇构成。该脂质纳米颗粒包裹Cas9mRNA和如上述第一个方面所述的sgRNA分子。

在本发明的一种实施方式中，该脂多肽分子为脂多肽的多聚体。在本发明的一种具体实施方式中，脂多肽为1,3,5-三(N¹,N³,N⁵-(3-双十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3)，聚乙二醇为PEG2000。

在本发明的一种实施方式中，脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇的摩尔比为15:25:45:0.75或15:30:40:0.75。Cas9mRNA和/或sgRNA与脂多肽分子的质量比范围为(1:10)-(1:5)。在一种优选的实施方式中，Cas9mRNA和/或sgRNA与脂多肽分子的质量比范围为1:10。

本发明的第三个方面涉及一种生物制剂，其包含本发明第二个方面所述脂质纳米颗粒、Cas9mRNA和/或本发明第一个方面所述的sgRNA分子，以及药学上可接受的赋形剂和辅料。

本发明的第四个方面涉及脂质纳米颗粒的制备方法，该方法包括：

(i)将脂多肽分子、胆固醇和聚乙二醇溶于酒精中，得到第一溶液；并将Cas9mRNA和/或sgRNA分子溶于水，得到第二溶液；