[发明专利]一种用于烟草花叶病毒定量检测的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于烟草花叶病毒定量检测的试剂盒及检测方法。

背景技术

烟草花叶病包括烟草普通花叶病和黄瓜花叶病，世界各烟区普遍发生。其中，我国南北烟区也有发生，尤其南方烟区受害较重。自苗期至收获期，烟区均能发病，且田间株发病率为5％～20％，个别田块可高达90％～100％。病叶在烤晒后颜色不均，烟味差，品质大为降低。烟区发病的损失可达50～70％，甚至失收。

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，烟草花叶病毒)，是一种单链RNA病毒，病毒粒体杆状，大小为300×18(nm)。体外保毒期为72～96小时。在无菌条件下致病力达数年，在干燥病组织内存活30年以上，是造成烟草花叶病的原因，对烟区的危害很大。

目前常用的烟草花叶病毒的检测方法有直接观察法、电子显微镜检测法、生物学检测法、血清学检测法和分子生物学检测法等。但目前的检测方法存在准确性低、灵敏度低，检测时间长，对检测者有专业的技能要求，专业仪器昂贵等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草花叶病毒定量检测试剂盒及检测方法，发明提供的试剂盒能够实现烟草花叶病毒的定量检测，且快速、准确度高、灵敏度高。

本发明提供了一种烟草花叶病毒定量检测试剂盒，包括如下分装试剂和酶标板：

所述酶标板为烟草花叶病毒抗体预包被酶标板；

所述分装试剂为：

样品稀释液，为磷酸盐缓冲液；

洗涤液，含质量分数为0.1～0.5％的Tween-20的磷酸盐缓冲液；

反应终止液，浓度为1.8～2.2mol/L的H₂SO₄溶液；

酶标抗体工作液，辣根过氧化物酶标记的浓度为2μg/ml的特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体；

显色剂；

烟草花叶病毒标准品。

所述烟草花叶病毒抗体预包被酶标板制备方法包括以下步骤：

1)将特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体用包被缓冲液稀释至浓度为1.8～2.2μg/ml，加至酶标板，30～37℃反应2～5h或4～8℃静置过夜；

2)用洗涤液对包被后的孔板进行洗涤；

3)用封闭液对洗涤后的孔板进行封闭，30～37℃反应2～4h；

4)对封闭后的孔板进行干燥，得到抗体预包被酶标板。

优选的是，所述一次孵育和二次孵育的温度独立地选自22～26℃，所述一次孵育和二次孵育的时间独立地选自40～50min。

优选的是，所述包被缓冲液为浓度为0.1mol/L，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液。

优选的是，所述封闭液为含质量浓度1～2％BSA的碳酸盐缓冲液。

优选的是，所述特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体的制备方法包括：

用烟草花叶病毒重组蛋白免疫BALB/c小鼠后，进行细胞融合和克隆化筛选，得到单克隆抗体细胞株；

将含有所述单克隆抗体细胞株的小鼠腹水纯化，得到特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体。

优选的是，所述酶标抗体的制备方法包括：

将辣根过氧化物酶水溶液与高碘酸钠水溶液混合，反应20～40min，得到辣根过氧化物酶预处理溶液；

将抗体溶于偶联缓冲液，使抗体浓度为2～20mg/mL，透析过夜，得到抗体预处理溶液；

将所述辣根过氧化物酶预处理溶液和抗体预处理溶液按照体积比为1：(0.5～2)混合，反应2h，得到酶-抗体偶联溶液；

将硼氢化钠与酶-抗体偶联溶液混合进行封闭反应，得到酶-抗体封闭溶液；

将酶-抗体封闭溶液在磷酸盐缓冲液中透析，得到酶标抗体工作液。

优选的是，所述显色剂为TMB显色剂。

本发明还提供了一种定量检测烟草花叶病毒的方法，包括以下步骤：

从待检样本中提取蛋白，得蛋白提取液；

用上述技术方案所述烟草花叶病毒定量检测试剂盒对所述蛋白提取液进行检测，所述检测过程包括加样、一次孵育、一次洗涤、加酶、二次孵育、二次洗涤、显色、终止和读数；

根据得到的读数与以烟草花叶病毒蛋白标准品制作的浓度-吸光度标准曲线，得到待检样品中的烟草花叶病毒蛋白浓度。