[发明专利]检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测黄曲霉毒素M1的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒。所述检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、黄曲霉毒素M1标准品、黄曲霉毒素M1的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

背景技术

黄曲霉毒素M1 (Aflatoxin M1，缩写AFM1)属于黄曲霉毒素一类结构相似的化合物中的一种，该类毒素是由常见的黄曲霉菌 和寄生曲霉菌产生的代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。

AFM₁是黄曲霉毒素M1的代谢物，其基本结构为一个二呋喃环的氧杂萘邻酮。溶于多种有机溶剂，如氯仿、乙腈、甲醇和水，但不溶于正已烷、石油醚、乙醚等非极性溶剂中，物理化学性质相当稳定，不被巴氏消毒破坏。

黄曲霉毒素是一种强烈的致癌物，而且是曲霉菌等菌类的高毒代物。大多数政府机构都对人体和动物可摄入的黄曲霉毒素量有严格的法规限制。很多国家已经对牛奶和乳制品中的黄曲霉毒素M1含量有了明确的限量标准。黄曲霉毒素1993年被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物。AFM1毒性主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时，可导致肝癌甚至死亡；流行病学研究结果表明：肝癌高发区的发病率与AFM1的摄入以及转化为尿中的AFM1的转化率有密切关系，但随着饮食结构的调整，人体直接摄入AFM1的机会越来越少，而动物乳中AFM1的存在对人类的危害变得至关重要。由于黄曲霉毒素M1相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉毒素M1不仅要在饲料原料中检测，而且在最终产品中也需要进行鉴定。乳业专家王丁棉表示，牛奶中的黄曲霉毒素来源于奶牛的饲料中，即使超量一点点，随着人在食物中的摄入，慢慢在人体积累也会致癌；在欧盟，牛奶和奶粉中的黄曲霉毒素M1含量被限制在0.05 mg/L 或50ppt。在中国，黄曲霉毒素M1国家规定的最高值为0.5μg/kg。

而时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对黄曲霉毒素M1检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种蔬菜水果中黄曲霉毒素M1残留的检测时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

本发明的目的之二在于提供一种快速简便地检测蔬菜水果中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，用于定量或定性地检测农作物中黄曲霉毒素M1残留量。

本发明目的之一是这样实现的：检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其关键在于由多孔包被板、缓冲液、黄曲霉毒素M1标准品溶液、抗黄曲霉毒素M1的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液体所组成。

本发明目的之二是这样实现的：检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测，其关键在于：

(1) 免疫原的制备：将半抗原黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白（BSA）偶联，得到免疫原（黄曲霉毒素M1-BSA）；

(2) 包被原的制备：将半抗原黄曲霉毒素M1与卵血清白蛋白（OVA）偶联，得到包被原（黄曲霉毒素M1-OVA）；

(3) 单克隆抗体的制备：