[发明专利]可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白及制备方法

权利要求书

1.一种可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白，其特征在于所述可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白的cDNA及氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.一种如权利要求1所述的可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

步骤1：以七鳃鳗CRBGP的cDNA为模板进行PCR反应，PCR反应引物序列如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCACATCCGTCAACGACTGGAAGCTC -3’

下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCGTAGGGTTTGTTGATCCTGGTGA -3’

步骤2：将PCR产物与原核表达载体pET-42a分别双酶切后进行连接，并将连接产物采用CaCl₂法转化至克隆菌Rosetta blue中，筛选阳性转化子；

步骤3：对于阳性转化子以终浓度为0.3 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于16℃诱导表达18小时；

步骤4：将诱导表达后的菌液于4℃、7500转/分钟离心15 分钟，收集菌体沉淀；

步骤5：所得菌体沉淀用20 mM pH 8.0Tris-HCl清洗，之后采用破菌液重悬菌体并于冰上超声破碎30分钟，10000转/分钟离心20分钟，收集沉淀；

步骤6：用包涵体洗涤液洗涤沉淀2次，10000转/分钟离心10分钟，收集沉淀；

步骤7：将沉淀加入到变性液A中，在4℃条件下用磁力搅拌器充分搅拌至

澄清，10000转/分钟离心30分钟，收集上清，将上清和复性液A装入透析袋中，用聚乙二醇浓缩；

步骤8：将透析袋放入20 mM Tris-HCl缓冲液中，于4℃透析过夜，析出白色蛋白液；

步骤9：取析出的白色蛋白液10000转/分钟离心30分钟，收集沉淀，并向沉淀中加入变性液B，在4℃条件下用磁力搅拌器充分搅拌至透明，10000转/分钟离心30分钟，收集上清；

步骤10：将上清加入到复性液B中，在4℃条件下用磁力搅拌器充分搅拌24小时后转移到透析袋中，置于20 mM pH 8.0Tris-HCl中，在4℃条件下用磁力搅拌器充分搅拌5小时，10000转/分钟离心30分钟，收集上清；

所述溶液如下：

破菌液：50 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 8.0；

包涵体洗涤液：50 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，2 M尿素，1 mM EDTA，0.5% Triton X-100，2 mM β-巯基乙醇，pH 8.0；

变性液A：50 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，100 mM β-巯基乙醇，7 M盐酸胍，pH 8.0；

复性液A：50 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，1 mM EDTA，100 mM β-巯基乙醇，pH 8.0；

变性液B：50 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，100 mM β-巯基乙醇，8 M尿素，pH 8.0；

复性液B：50 mM Tris-HCl，0.75 M L-Arg，5 mM还原型谷胱甘肽，0.5 mM氧化型谷胱甘肽，pH 8.0。