[发明专利]一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用

说明书

一种多环芳烃降解基因工程菌株，该菌株Pseudomonas putida GLEB3已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏编号：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明可有效提高基因工程菌株在生长过程中的可控性，降低应用其进行微生物强化修复过程中的生物安全风险。

技术领域

本发明涉及一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用。

背景技术

在过去的十几年内，应用基因工程菌(GEB)进行环境修复的研究进展比较缓慢。单从技术角度来讲，研究学者们已经发现了大量的可以用于生物修复的遗传系统，通过基因工程改造微生物的相关代谢系统可以大大提高其对污染物的降解效率，因此GEB往往都具有良好的特异性降解能力。而真正限制GEB应用于环境修复的因素往往是其未知与不可控的生态风险，这些菌株所携带的外源抗性基因一旦通过水平转移进入其他生物体内，可能造成较为严重的抗性基因污染，同时GEB多为外来物种，其生长代谢是否会对土著微生物群落产生影响，均存在较大的不确定性。

为了解决上述问题，GEB在应用于环境修复前往往需要经过复杂而漫长的评估过程。如何将其改造得易监测、可控制是未来基因工程菌构建技术发展的趋势。研究表明，向GEB中导入可调控的自毁系统(Active biological containment systems，ABC)可以实现对菌株的人为诱导衰亡，该方法主要是通过调控导入的自杀基因得以实现。具有ABC系统的细菌一旦遇到诱导物质，其携带的自杀基因则会通过破坏细胞膜、降解核酸物质等方式启动自杀机制。虽然该系统功能的发挥会受到诱导物质接触程度、细菌胞内蛋白表达量等多方面因素的影响，无法保证100％的致死率，但该系统对实现人为控制GEB在环境中的生长、防范其扩散仍具有极大地应用潜力。

发明内容

针对应用基因工程菌进行土壤修复过程中潜在的抗性基因污染及外源菌株扩散等生物安全风险，本发明提供一种具有诱导自毁机制的多环芳烃降解基因工程菌、其构建方法、应用以及自毁效率检验方法。

一种多环芳烃降解基因工程菌株，该菌株Pseudomonas putida GLEB3已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏编号：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地：

所述构建方法包括以下步骤：

1)lac启动子与核酸酶基因nuc的融合

以pAH12质粒为模板，采用引物nuc-f与nuc-r扩增核酸酶基因nuc。随后采用Nde I和Hind III酶分别酶切扩增产物及pUC-18质粒，16℃连接过夜，构建pUC-nuc载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞后，筛选阳性克隆；菌落PCR及酶切验证后，提取质粒，采用引物lacnuc-f与lacnuc-r扩增连接有上游lac启动子及操纵子的nuc基因，得到lacnuc融合基因；

2)重组转座子载体pUT-lacnuc的构建

切胶回收后lacnuc融合基因的PCR产物并进行纯化，采用Not I酶进行酶切，同时切割质粒pUT-mini Tn5(Km)；连接酶切产物，得到重组质粒pUT-lacnuc；

3)基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建