[发明专利]一种永生化鸡胚胎肝细胞系及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种永生化鸡胚胎肝细胞系及其制备方法和用途，属于生物学领域，具体的属于生物工程及兽用生物制品技术领域。

背景技术

自2013年以来，I型禽腺病毒在我国禽养殖场大量传播，引发了严重疫情，对养殖场造成重大经济损失。

对于这一病毒，目前我国采用的主要防治手段是使用禽腺病毒相关疫苗。现有技术我们通常采用SPF鸡胚或原代鸡胚肝脏细胞进行禽腺病毒增殖，从而获得相关疫苗。

但是，这两种方式都具有一定的缺陷。譬如，SPF鸡胚的使用会产生大量的病毒污染生产废弃物，而原代鸡胚肝脏细胞的获得同样需要使用SPF鸡胚，并且原代细胞的制备操作又极为费时费力、易污染。因此，现有的禽腺病毒疫苗制备工艺落后，生产效能低下，无法满足禽养殖场的实际免疫需求。

细胞永生化技术可以使得目标细胞获得在体外连续传代增殖的能力。如果能够对原代鸡胚胎肝脏细胞进行永生化改造，获得永生化原代鸡胚胎肝脏细胞系，就可以实现I型禽腺病毒在连续传代细胞系中进行增殖。从而免去每次制备原代细胞的繁琐操作，提高病毒抗原的制备效率。解决目前禽腺病毒相关疫苗生产中的实际问题。

更为重要的是避免了SPF鸡胚的使用，避免污染。

但是，对于原代细胞永生化的机理仍不完全明了，一般认为是原代细胞在若干传代或基因工程操作后发生了细胞染色体的不稳定重排而导致了细胞永生化，从而具备了体外连续传代增殖的能力。目前，原代细胞永生化的改造方法包括自发永生化驯化、外源病毒感染导致永生化、重组表达外源病毒蛋白导致永生化这三种。

发明内容

本发明主要目的是提供一种永生化鸡胚胎细胞系及其制备方法。该永生化鸡胚胎细胞系具有原代鸡胚胎细胞的主要功能，并且能够在体外连续传代。

为了实现这一目的，我们公开了一种永生化鸡胚胎肝细胞系，该永生化鸡胚胎肝细胞系CEL-hMRP18S-2于2016年12月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.13290.保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

这一永生化鸡胚胎肝细胞系是通过真核表达载体pCAG-hMRP18S-2向原代鸡胚胎肝细胞转染hMRP18S-2基因，以G418药物经两轮筛选后连续传代扩增而得。

具体地，这一制备方法可以描述为：

1）使用带有KpnI和NotI酶切位点的上下游引物从含有hMRP18S-2编码序列的pUC-hMRP18S-2质粒上扩增该片段，经双酶切后克隆至同等双酶切的真核表达载体中，构建成hMRP18S-2（人线粒体核糖体蛋白18S-2）的真核表达载体pCAG-hMRP18S-2，用于转染操作。

该真核表达载体中CAG启动子中有部分鸡β-actin的启动子序列，应用在禽来源的细胞中具有较强的启动转录活性。

2）将pCAG-hMRP18S-2转染至原代鸡胚胎肝细胞后，以G418药物两轮筛选，得到对G418药物具有抗性，可稳定表达hMRP18S-2蛋白的重组鸡胚胎肝细胞。

3）收集重组鸡胚胎肝细胞并实施连续传代扩增，得到永生化鸡胚胎肝细胞系CEL-hMRP18S-2。

本发明的发明人对于这一细胞系连续传代扩增培养100代，并按照不同的代次分别冻存细胞，进行功能和特征检测表明传代100代后，仍能够保留原鸡胚胎肝细胞的主要特征和主要功能。

其中，优选地，步骤1）中人线粒体核糖体蛋白18S-2的核酸编码序列是根据禽源密码子偏嗜性进行优化的重组核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

并且，作为另一优选，步骤2）中G418药物的2轮筛选是指分别使用浓度为200ug/ml和400ug/ml的G418药物溶液，并且在不同浓度下均进行20代连续筛选。

同时本发明还进一步公开了这一永生化鸡胚胎肝细胞系在I型禽腺病毒增殖中的应用。

具体来说，其应用方式为：

1）连续传代扩增CEL-hMRP18S-2细胞并建库。

该细胞具有贴壁生长的特性，置于37℃，5%CO2的培养环境下，细胞生长汇合度达到90%即可进行禽腺病毒接毒操作。

2）按照MOI为0.1接种I型禽腺病毒于CEL-hMRP18S-2细胞中，接毒后3～5天细胞即可出现明显细胞病变。