[发明专利]一种稳定低表达SMMC7721的细胞系及构建方法

说明书

本发明公开一种ALDH18A1低表达的SMMC7721细胞系的构建方法。具体采用shRNA干扰技术构建ALDH18A1稳定低表达的SMMC7721细胞系。经过获得ALDH18A1shRNA重组质粒、包装病毒，然后对病毒感染后的细胞进行嘌呤霉素筛选，传代，建立稳定低表达的SMMC7721‑ALDH18A1KD细胞系，最终获得阳性重组细胞系，能够低表达ALDH18A1。ALDH18A1稳定低表达的SMMC7721细胞系可作为理想的模型来进行ALDH18A1参与的肿瘤发生发展机制的研究。

技术领域

本发明涉及到细胞生物学技术，具体涉及一种采用ALDH18A1-1ShRNA技术构建ALDH18A1稳定低表达的SMMC-7721细胞系的方法。

背景技术

乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)是近来新发现的癌症相关基因，ALDH超家族是一类是NADP+依赖的酶，具有多功能的蛋白。目前为止，研究发现至少有19个ALDH基因。人类的ALDH超家族成员有：1A1、1A2、1A3、1B1、1B2、1L1、1L2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、5A1、6A1、7A1、8A1、9A1、16A1和18A1分别定位于不同染色体区段上。该超家族中多个成员的的活性已证实于细胞的增殖、凋亡、信号转导、细胞周期等多个生物学过程相关。现阶段研究表明，在乳腺癌、结肠癌、白血病、肺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多种癌症中均发现ALDH的表达异常。这些提示ALDH作为癌症相关的调控酶在肿瘤发生、发展、转移等方面均有重要作用。

ALDH18A1定位于线粒体的内膜，其在人肾脏、胰腺、卵巢和睾丸等处中高表达，在心脏和骨骼肌、结肠等处中度表达。ALDH18A1包含两个结构域：N末端的γ-谷氨酰激酶结构域和C末端的γ-谷氨酰磷酸还原酶结构域。ALDH18A1通过催化谷氨酸盐的还原反应，生成△－吡咯啉－5－羧基合成酶(P5C)，P5C再进一步转变为鸟氨酸。该通路涉及脯氨酸和精氨酸的从头合成，作为能量代谢通路的关键酶在肿瘤发生发展中起到至关重要的作用。ALDH18A1的突变可引起一系列如低脯/鸟氨酸血症、低精氨酸血症和伴有神经退行性变及结缔组织异常的高氨血症等代谢异常疾病。

癌症现阶段已成为全球健康的首要杀手，每年都有大量人员因癌症导致死亡。其中，肝癌是位居第二的致死性癌症，同时也是近年来发病率一直呈上升趋势的癌症种类之一。现阶段研究表明，肝癌的发生发展与能量代谢异常有着密切的关系。因此建立一系列人肝癌细胞系会为肝癌发生发展的机制研究和临床用药指导提供研究基础。

RNA干扰技术是近些年来发展起来的一项基因沉默技术，该技术的出现为研究基因的功能、信号通路及基因治疗等方面都提供了新的研究手段，与传统的基因工程技术相比，其具有特异性强、级联放大等优点。但是siRNA为化学合成，转染后在细胞内可被降解，从而导致沉默效率较低；而shRNA可视为在载体上连接siRNA序列，将载体转入细胞后在细胞内转录生成shRNA，细胞内的Dicer酶将其修饰后生成相应的siRNA，从而发挥RNAi作用，而且干扰效果更稳定、更持久。常用的构建shRNA的病毒表达载体有腺病毒载体、慢病毒载体等，这些病毒载体的作用机制与质粒载体相似，但是病毒相对于质粒具有感染效率高的特点，从而解决了质粒载体转染效率低等缺陷。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种ALDH18A1低表达的SMMC-7721细胞系的构建方法。本发明采用ALDH18A1shRNA干扰技术构建ALDH18A1稳定低表达的SMMC-7721细胞系，即SMMC-7721ALDH18A1KD细胞系。

本发明通过下述技术方案实现：

本发明的一方面在于：ALDH18A1稳定低表达的SMMC-7721细胞系的构建方法，包括如下步骤：

(a)病毒的构建及富集