[发明专利]一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法及应用

说明书

本发明提供一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能的模拟酶的制备方法及应用。采用“一锅式”原位合成法，碱性条件下，将血红素与氯金酸混合，进而以血红素作为还原剂和稳定剂，实现金的原位生物矿化，制得具有Hemin过氧化物酶催化和金催化活性的Hemin‑AuNCs复合物；发挥其纳米导线功能，促进了Hemin催化反应的电子传输能力，同时增强了对底物的吸附能力，其催化活性显著高于常见Hemin（4倍以上）；制备方法不涉及复杂光电仪器使用，具有催化活性高、操作简单、响应快速、成本低廉等优点。以癌症标志物甲胎蛋白的免疫分析为例，将该Hemin‑AuNCs复合物应用于标记AFP抗体，然后采用酶联免疫吸附法，通过酶催化和金催化银沉积信号放大途径，实现了对血液中癌症标志物甲胎蛋白的高灵敏检测。

技术领域

本发明属于酶催化与传感检测技术领域，涉及一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能的模拟酶的制备方法及应用。

背景技术

酶联免疫吸附法(ELISA) 和金催化银沉积染色法是两种常见的高灵敏检测技术，在疾病标志物（如蛋白质和生物小分子）检测中得到了广泛的应用。这两类检测技术分别涉及抗体的酶标记和金标记，例如，辣根过氧化物酶（HRP）常用于标记抗体，但存在价格昂贵、容易失活、储存条件苛刻等局限性。因此，选用价格低廉又具有高催化活性的类酶催化剂代替HRP成为目前ELISA检测技术领域的研究热点。

此外，氯化血红素和亚铁血红素是HRP等血红素类蛋白质的催化活性中心，能够催化H₂O₂氧化底物反应产生颜色变化，表现出了类过氧化物酶的活性。然而，将血红素直接应用于各种催化领域仍然面临很大的挑战，例如，血红素本身催化活性低且不溶于水，在水溶液中易聚集成催化活性很低的二聚体，同时，其在氧化性媒介中结构易被破坏而致催化活性减弱。

为了解决这些问题，研究工作者们尝试采用对血红素进行化学修饰或固定化以改良其催化性能。近年来，随着纳米制备技术的高速发展，贵金属纳米材料也被广泛用于改善蛋白酶及其模拟物的催化活性。采用纳米金颗粒修饰过氧化物酶以提高其催化性能的研究已被广泛报道；特别是，经过生物矿化生成的小尺寸（小于5 nm）金纳米颗粒不仅本身具有一定的过氧化物酶活性，而且尚具有优良的催化银沉积活性。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，通过模拟天然酶的催化原理，制备基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶，即Hemin-AuNCs复合物。

同时，本发明还提供了上述Hemin-AuNCs复合物的应用，并以癌症标志物甲胎蛋白(AFP)的免疫分析为例，将之应用于标记AFP抗体。进而采用酶联免疫吸附法（ELISA），分别通过酶催化TMB-H₂O₂比色和金催化银沉积信号放大途径，实现了对血液中AFP的高灵敏检测。

本发明的技术方案如下：

一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法，步骤包括：

（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.05～1.25 mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl₄溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0 M的NaOH溶液；

（2）将步骤（1）制备的HAuCl₄溶液与Hemin溶液各1.0mL等体积混合，5 min后，剧烈搅拌下加入20～200 μL NaOH溶液，然后在水浴中继续搅拌，0～80℃反应1～12 h，离心分离，取上清液去离子水透析处理，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶（即Hemin- AuNCs复合物）。

步骤（1）中，所述的Hemin溶液，浓度优选0.8 mg/mL。

步骤（2）中，所述的NaOH溶液用量优选120 μL