[发明专利]一种利用内醚糖产乙醇的双质粒大肠杆菌工程菌的构建方法

说明书

本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域，涉及利用纤维素废弃物热解液中内醚糖进行生物乙醇发酵的基因工程菌株E. coli BLG，该菌株通过将含有内醚糖激酶基因lgk（SEQ ID NO. 1）的质粒pet21a‑lgk以及质粒pZBC，导入大肠杆菌BL21得到，保藏登记号为CGMCC NO. 13269。本发明提供的菌株可以高效利用内醚糖发酵乙醇，具有一定工业化潜力。

技术领域

本发明属于基因工程及微生物技术领域，涉及质粒载体的构建、转化以及重组菌株的筛选、发酵等。

背景技术

在当今环境污染加剧以及气候变暖的影响下，传统的化石燃料的使用受到了越来越多的挑战。因此，绿色清洁能源的发展得到了世界各国的重视。生物乙醇作为一种可再生的清洁燃料，是解决目前环境问题的一条重要途径。而生产生物乙醇的原料中，除了已被限制使用的粮食作物外，还有储量巨大、且尚不能被有效利用的纤维素生物质。

微生物发酵是生产生物乙醇的一种主要技术，但微生物难以利用大分子结构的纤维素生物质，因此必须在发酵前将纤维素类物质分解成单糖或二糖的形式。而如今分解纤维素普遍采用的酸解及酶解方法二次污染严重，反应时间长及工艺成本高，故近年来有学者提出利用真空热解技术来快速分解纤维素成单糖。纤维素热解后的主要产物是一种叫做内醚糖（levoglucosan，C₆H₁₀O₅）的单糖，其可以被一些微生物如黑曲霉（Aspergillus niger）、斯达油脂酵母（Lipoomyces starkeyi）和嗜松青霉（Penicillium pinophilum）等利用，但这些微生物不能代谢产乙醇。目前，自然界中产乙醇的微生物如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）却都不能利用内醚糖。在以往的研究中，利用内醚糖产乙醇的方法主要是先将内醚糖用硫酸水解成葡萄糖，中和后再利用产乙醇微生物进行发酵，这种抛弃捷径走弯路的方法大大地增加了中间过程成本，不利于工业上的大规模应用。

而大肠杆菌（Escherichia coli）作为基因改造的模式受体菌株，由于其繁殖快、代谢产物产率高等特点，经常被用来构建工程菌。本发明旨在将能转化内醚糖的内醚糖激酶基因lgk和能产乙醇的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adh同时导入E. coli 中，构建同时具有内醚糖同化和乙醇生产功能的工程大肠杆菌。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是：构建出既能利用内醚糖又能生产乙醇的大肠杆菌工程菌株，实现纤维素热解液到生物乙醇的一步转化。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

1、内醚糖激酶基因lgk来源于自己筛选的L. starkeyi YZ215，其cDNA序列经密码子优化后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见SEQ ID NO. 1。

2、丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adh来源于Z. mobilis，由质粒载体pZBC提供，pZBC提取于E. coli ACCC 11177（实验室保存）。