[发明专利]一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法

说明书

本发明公开了一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括胚性愈伤组织的诱导、增殖，体细胞胚的成熟、萌发和转化；所述的体细胞胚的成熟培养采用液—固增殖‑固成熟方式进行。本发明的高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，以抗松材线虫病赤松的未成熟合子胚为外植体，通过对抗病赤松未成熟合子胚已成功诱导获得的胚性愈伤组织进行体细胞胚成熟、萌发与植株再生等试验，成功获得了成熟的体细胞胚和再生植株，并移栽成活，在成熟培养基上产生体细胞胚的萌发率和植株转化率高，分别为67.2%和46.5%，为抗病赤松的大规模繁殖和工厂化生产提供了重要的科学依据和技术支撑。

技术领域

本发明属于树木育种技术领域，具体涉及一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法。

背景技术

赤松(Pinus densiflora)，主要分布于日本、朝鲜、俄罗斯东南部及我国东部，可作庭院、荒山造林的树种，但易感染松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)而大量死亡，对林业生产和生态环境造成了严重破坏。由于常规种苗繁殖系数低，选育出的抗病材料难以满足大规模林业生产的需求。为了大量快速繁殖已选优良抗病基因型，在短时间内实现规模化生产，对赤松离体组织培养技术的研究显得尤为重要。

体细胞胚胎发生具有繁殖系数大、周期短、结构完整、再生率高、不受季节影响等特点(Gupta et al,1993)，是植物大规模无性繁殖的一种主要手段(汪小雄等，2006；Stasolla and Yeung,2003)。国内外学者已通过体细胞胚胎发生成功获得50多种针叶树体细胞胚或体细胞胚再生植株(孙志强等，2010)，其中火炬松(Pinus taeda)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)和辐射松(Pinus radiata)等树种体细胞胚发生已经应用于规模化生产(张守攻，2004)。Taniguchi(2001)首次对日本赤松体细胞胚胎发生进行研究，建立了胚性细胞系和进行体细胞胚胎成熟试验，但转化率非常低；随后，Maruyama等(2005)、Maruyama和Hosoi(2012)、Shoji等(2006)、Kim等(2014)研究了赤松胚性愈伤组织增殖、体细胞胚胎成熟、萌发及转化的影响因子，但存在胚性愈伤组织诱导率低、胚性愈伤组织能力的丧失，体胚成熟与转化率低等问题。而国内外目前对赤松组织培养器官发生植株再生有所研究(朱丽华等，2010；李清清，2012)。目前国内关于赤松体细胞胚胎发生的研究报道很少(吴静等，2015)。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，为抗病赤松体细胞胚胎发生条件进行优化以提高其体细胞胚胎的质量和数量，从而来提高萌发率和植株转化率，为抗性赤松的种质资源保存、基因转化、体胚苗的工厂化生产提供可行的技术支撑。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种高同步化的抗松材线虫病赤松体细胞胚胎发生及植株再生方法，包括胚性愈伤组织的诱导、增殖，体细胞胚的成熟、萌发和转化；所述的体细胞胚的成熟培养采用液—固增殖-固成熟方式进行。

所述的液—固增殖-固成熟为：取生长良好的胚性愈伤组织，转入不含激素的DCR液体培养基中，剧烈震荡形成良好的悬浮体系，取培养好的悬浮液，均匀分散在灭菌后的滤纸上，用脱脂棉吸取水分，待水分沥干后，将有培养物的滤纸放入配制好的固体增殖培养基中，15天之后转入固体成熟培养基中。

所述的体细胞胚的萌发为：将诱导的成熟体细胞胚22#-1水平置于萌发培养基上进行萌发，萌发培养基为LP，添加20g/L麦芽糖，2g/L AC，3g/L植物凝胶，pH5.8；非直射光培养4-7天，再放入直射光下培养14-17天；然后将萌发的体细胞胚转入WPM基本培养基，附加1.5mg/L IBA，0.2mg/L NAA，15g/L蔗糖，0.1g/L肌醇，7g/L卡拉胶，光照培养1个月。