[发明专利]一种磷酸化肽富集材料及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及材料分析化学和有机化学领域。本发明提供一种磷酸化肽富集材料及其制备方法与应用。该磷酸化肽富集材料包括基底及形成于基底表面的双组分共聚物层，双组分共聚物层的厚度为10‑80nm。本发明是利用表面引发‑原子转移自由基聚合反应机制，将双组分共聚物接枝到基底表面。本发明将该材料与柱固相萃取模式或分散固相萃取模式有机的结合可实现复杂混合物中磷酸化肽高选择性、高重复性和高通量地富集，从而实现多磷酸化肽和单磷酸化肽的选择性富集，可显著提高磷酸化蛋白鉴定数目。因此，其有望在磷酸化肽富集，进而大规模分离磷酸化蛋白等方面获得广泛的应用。

技术领域

本发明涉及材料分析化学和有机化学领域，尤其涉及一种磷酸化肽富集材料及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质的磷酸化是生物体内最常见、最重要的蛋白翻译后修饰方式之一，因此磷酸化蛋白质组学研究引起了众多世界科学家的广泛关注。但是由于磷酸化蛋白质在生物体内绝对含量很低，目前，进行磷酸化蛋白质组学研究的技术策略主要是在蛋白质或肽段水平上富集之后进行。已有的磷酸肽富集方法主要有：固定金属离子亲和色谱法，金属氧化物法，离子交换色谱法，以及上述几种技术的联用。但是这些方法存在多磷酸化肽难以洗脱、非特异性吸附酸性肽链或者带碱性残基磷酸化肽难以保留的问题，因此无法实现复杂生物样品大规模富集磷酸化肽的目的。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题提供一种对磷酸化肽具有显著识别能力的磷酸化肽富集材料及其制备方法与应用。该材料提供了一种具有高选择性、高吸附量、操作简单和重复性好的磷酸化肽的分离富集方法，能对生物样品中相对低含量的单磷酸化肽和多磷酸化肽进行选择性富集和分离。

本发明采用如下技术方案来实现：

一种双组分共聚物，所述双组份共聚物具有如下所示的分子结构：

其中R为羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5。

上述方案中，包括基底及形成于基底表面的双组分共聚物层，所述双组分共聚物的分子结构如权利要求1所述，所述双组分共聚物层的厚度为10-80nm。

上述方案中，所述基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。

所述的磷酸化肽富集材料的制备方法，该制备方法是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将双组分共聚物接枝到基底表面，具体制备方法如下：

1)在反应容器中依次加入异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体，同时加入超纯水及二甲基甲酰胺的混合溶液作溶剂，其中，异丙基丙烯酰胺和硫脲功能单体的摩尔比1-20:1，超纯水与二甲基甲酰胺的体积比为1:1-10；

2)在无氧条件下加入催化剂和配体，将基底浸入前述溶液中，保持氮气气氛，在恒温60-80℃条件下进行原子转移自由基聚合反应4-24小时；

3)反应结束后，洗涤基底表面并在30-80℃下真空干燥，得到所述磷酸化肽富集材料。

所述的磷酸化肽富集材料在磷酸化肽富集分离中的应用方法，采用柱固相萃取模式，具体步骤如下：

1)将磷酸化肽富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用活化液和平衡液活化及平衡微固相萃取柱，将蛋白酶解物溶解于平衡液中，并上到微固相萃取柱上，磷酸化肽富集材料与蛋白酶解物的质量比为100:1-1000:1；

2)采用5-200倍柱体积pH 0-7的有机溶液冲洗萃取柱；