[发明专利]多种益生菌混合发酵高产工艺

权利要求书

1.益生菌混合发酵高产工艺是利用不同乳酸菌混合发酵存在的共生机制，从而更充分的利用发酵原料，大大提高活菌量，为工业化生产高活菌数的乳酸菌制剂提供参考，方法如下：

步骤一，碳源、氮源、无机盐等最优组分的筛选；

步骤二，培养基各组分最优质量浓度的确定；

步骤三，最优发酵培养基的确定；

步骤四，最优培养基发酵条件的优化；

步骤五，乳酸菌种子液的制备。

2.根据权利要求1所述的碳源、氮源、无机盐等最优组分的筛选，主要对所需要的发酵培养基的不同组分进行选择，从而获得最利于混合发酵的培养基，其方法是碳源选择麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉；氮源选择胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钠、胰蛋白胨与酵母膏混合（1:1）；无机盐选择KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、乙酸钠、K2HPO4，3株菌种的种子液按1:1:1（接种总量为1.5%）的比例接种于不同培养基中，将培养基初始pH调节至7.5，在37℃、200r/min条件下振荡培养24h，采用紫外可见分光光度计600nm下测定发酵液的OD值，确定最佳组分为蔗糖、胰蛋白胨酵母膏混合，Na2HPO4。

3.根据权利要求1所述的培养基各组分最优质量浓度的确定，其方法是在已经确定最佳碳源、氮源、无机盐种类的基础选择不同浓度进行混合发酵试验，最佳碳源的浓度5g/L、7.5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L；最佳氮源浓度5g/L、7.5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L；最佳无机盐浓度4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L，培养基初始pH7.5，在37℃、200r/min条件下振荡培养24h，采用紫外可见分光光度计600nm下测定发酵液的OD值，确定最佳浓度分别为碳源7.5g/L，氮源10g/L，无机盐6g/L。

4.根据权利要求1所述的最优发酵培养基的确定，将试验中筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐及其浓度范围按L9（34）正交表进行正交试验，培养基初始pH7.5 ，接种量1.5%，发酵温度37℃，摇床转速200r/min，24小时后测发酵液OD值，结果为蔗糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，Na2HPO4 7g/L。

5.根据权利要求1所述最优培养基发酵条件的优化，用优化的最佳培养基进行复合菌发酵，选取26℃、28℃、31℃、34℃、37℃和40℃ 作为发酵温度，测定不同温度下复合菌的OD值；选取0.5%，1%，2%，3% 接种量，测定不同接种量下OD值；选取5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0作为初始pH，测定不同初始pH下复合菌发酵后的OD值；选取100 r/min，120 r/min，140 r/min，160 r/min，180 r/min，200 r/min和220 r/min 摇床转速，测定不同转速下复合菌发酵后的OD值，最佳温度、接种量、初始pH、转速分别为37℃、0.5%、8.5、200r/min。

6.根据权利要求1所述乳酸菌种子液的制备，将三株菌种种子液按照0.5%接种量接种于优化得到的最佳培养基中，调节培养基的初始pH为8.5，在37℃、200r/min摇床培养，发酵16h时达到对数生长期的最高峰，通过微量计数得到此时的活菌数为1.8×1013 cfu/mL。