[发明专利]一种丝氨酸129位磷酸化alpha‑突触核蛋白聚集体的ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及聚集化的丝氨酸129位磷酸化alpha-突触核蛋白(α-syn)检测方法的建立。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)作为最常见的神经退行性疾病之一，分别影响65岁和85岁年龄中1％和5％的人口，alpha-突触核蛋白(α-syn)作为2014年新修订的对PD定义的核心蛋白，已引起人们高度重视α-syn在PD早期诊断、病程和药物疗效检测中的实际应用。因此，现在急需一种或多种灵敏且特异的检测方法，检测各种形式的α-syn随着PD的发生发展在人体液中的变化趋势，这就要求这种检测方法要客观、可行，并易于在临床上得以推广。路易体(Lewy’s Body,LB)作为PD主要的病理标志物，其主要成分由α-syn组成，而在LB中有90％的α-syn在129位发生了磷酸化(pS129-α-syn)。为了研究PD病程的进展，人们利用了多种方法监测α-syn在体内的变化趋势，纵观近几年的检测α-syn的文献，报道PD患者体液中的α-syn含量不尽相同，但是磷酸化α-syn和α-syn聚集体的含量增加是基本一致的报道。在上述有意义的研究报道中，检测的磷酸化α-syn是单体形式和α-syn的聚集体形式，而没有明确聚集体中α-syn是磷酸化形式还是非磷酸化形式，更没有检测聚集状态的磷酸化α-syn，因为目前尚没有检测聚集化pS129-α-syn的方法。而聚集的磷酸化α-syn在PD发生发展过程中发挥更关键的作用。而且有文献报道，活性醛类——包括ONE(4-oxo-2-nonenal),HNE(4-hydroxynonenal)——在PD患者的脑脊液中的含量随疾病进展而不断升高，它们作为脂质过氧化的产物，可以与α-syn的第50位组氨酸发生加合(如下)。而促使α-syn更易发生聚集。考虑到建立标准曲线所需使用的标准抗原的单一性，本专利使用HNE的氧化副产物(Oxidative Counterpart)ONE促进人源α-syn和pS129-α-syn发生聚集，建立基于夹心法ELISA的检测方法，以便将来观察临床脑脊液、血浆、大脑匀浆中聚集化的pS129-α-syn随病程的变化趋势。

HNE和蛋白质的组氨酸通过1,4-Michael加合对蛋白进行翻译后修饰

因此，我们发明的聚集化丝氨酸129位磷酸化α-突触核蛋白的检测方法具有重要意义。为临床PD的血液及脑脊液样品及基础研究的PD模型的聚集化丝氨酸129位磷酸化α-突触核蛋白的检测提供了检测手段，也有可能通过此方法建立PD的诊断试剂盒。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:

1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质，

2)加受检标本,保温反应，标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其他未结合物质，

3)加酶标抗体,保温反应，固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关，

4)加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物，通过比色,测知标本中抗原的量，这种双位点夹心法具有很高的特异性。

在临床检验中,双抗体夹心法法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。