[发明专利]CPT‑Ⅱ在脂肪积聚肝细胞诱发恶性转化过程中的应用

说明书

技术领域

本发明属于医药研究开发利用领域，具体涉及一种CPT-Ⅱ在脂肪积聚肝细胞诱发恶性转化过程中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是除酒精和其他明确的损肝因素外，所致的以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主、肝脏脂质蓄积过多的临床病理综合症，包括单纯性脂肪肝及演变的脂肪性肝炎和肝硬化，按肝脂肪超过肝重程度分为轻度、中度和重度脂肪肝。NAFLD已是欧、美、日等国慢性肝病的首要病因，也是我国除乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染外，肝细胞癌（HCC）发生的主要危险因素之一，其发病机制极为复杂，国内外有关研究学说众多，主要有胰岛素抵抗、脂质过氧化、细胞因子过表达、脂质代谢紊乱和铁超载等，除此，遗传、环境、免疫和药物等对NAFLD的发生均有影响，NAFLD主要表现为脂代谢紊乱。

在正常脂代谢过程中，体内脂肪酸活化生成酰基CoA，通过肉毒碱运载进入线粒体才能氧化供能。位于线粒体内膜肉毒碱棕榈酰转移酶-Ⅱ（Carnitine palmitoyltransferase-II，CPT-II）是脂肪酸进入线粒体氧化的关键酶。在线粒体外膜脂肪酸与CoA借助线粒体外膜肉毒碱棕榈酰转移酶-I（CPT-Ⅰ），将脂酰和肉毒碱转变为脂酰肉毒碱，经内膜CPT-II作用进入基质转换为脂酰CoA进行β-氧化供能，而肉毒碱则再穿过线粒体内膜，与内源性或外源性酰基CoA结合，防止后者堆积造成细胞中毒。

目前已有研究，体内长链脂肪酸须肉毒碱转运通过线粒体内膜进入基质氧化，足量肉毒碱对脂肪酸氧化供能极为重要。肝炎病毒感染后需要内源性代谢物与肉毒碱竞争结合，抑制CPT-II表达或减低酶活性，出现肉毒碱缺乏、酰基CoA和脂肪酸积聚，损伤线粒体，导致能量代谢障碍，在此过程中，如肉毒碱缺乏，血游离脂肪酸就会增多，导致内脏脂肪积滞，生成异常的内源性代谢产物二羧酸，加重线粒体损伤。

近年来，NAFLD与HCC之间的关联已引起临床的高度重视，有文献报道以先天性肉毒碱缺乏鼠（Juvenile Visceral Steatosis，JVS）制作动物模型，发现无论是杂合子（jvs/wt）或纯合子（jvs/jvs）鼠，均出现严重的肝脂肪积聚。肝细胞发生脂肪积聚是多因素、多阶段的动态变化过程，肝脂肪积聚与位于线粒体膜内侧的CPT-II活性密切相关，CPT-II控制脂肪进入线粒体氧化，该酶对热敏感，受过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）家族调控，且存多种变异。酶的催化功能是否正常，直接影响到脂肪氧化供能。然而，CPT-II活性高低与脂肪积聚关系尚未有文献报道过，在脂肪积聚状态下肝细胞恶性转化过程中表达与改变尚不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种CPT-II在脂肪积聚肝细胞诱发恶性转化过程中的应用，动态观察了肝组织CPT-II表达与改变，从新角度探讨脂代谢异常与肝细胞恶性转化的关系。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种CPT-Ⅱ在脂肪积聚肝细胞诱发恶性转化过程中的应用。

其中，CPT-Ⅱ在脂肪积聚肝细胞诱发恶性转化过程中的应用，包括如下步骤：

（1）动物分组：任挑10只雄性Sprague-Dawley大鼠为对照组，然后以6只雄性Sprague-Dawley大鼠为一组，随机分配成至少8组脂肪肝组和至少8组诱癌组；

（2）模型制备：脂肪肝组大鼠予以高脂饲料喂养，诱癌组大鼠予以高脂饲料加0.05%的2-乙基氨基芴颗粒饲料喂养，每两周取1只正常鼠、一组脂肪肝鼠和一组诱癌鼠，细分成对照组、脂肪肝组、变性组、癌前组和癌变组，各组大鼠以乙醚麻醉，经鼠腹心脏抽取全部血液，分离出血清置-18～-25℃保存；

摘取对照组、脂肪肝组、变性组、癌前组和癌变组各组大鼠的鼠肝组织，都分成至少3份备用；

（3）血液酶学及脂质检测：定量测定步骤（2）中对照组、脂肪肝组、变性组、癌前组和癌变组各组大鼠血液分离出的鼠血清中总胆固醇（Tch）、甘油三酯（TG）、血清谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST）的吸光度值（A），根据标准曲线计算其含量；

（4）肝组织脂肪染色：步骤（2）中对照组、脂肪肝组、变性组、癌前组和癌变组各组大鼠的鼠肝组织各取一份于液氮速冻后-80℃保存，冰冻切片，然后以油红O试剂进行脂肪染色，在光镜下进行观察、摄片，通过图像分析系统，测定每个视野的红色区域的面积与该视野总面积的比值，以代表每个肝组织中脂肪的相对含量，进行图像分析半定量研究；