[发明专利]一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用，构建方法为：(1)以大肠杆菌△A为出发菌株，通过基因敲除或基因沉默的方法使大肠杆菌△A染色体上的galE，galT和ugd基因不表达，得到大肠杆菌菌株BMGU；(2)向大肠杆菌菌株BMGU中导入ARO10，UGT73B6^MK，pgm，galU和T7Polymerase基因，使ARO10，UGT73B6^MK，pgm，galU和T7Polymerase基因过表达，异源合成红景天苷，得到一种生产红景天苷的重组大肠杆菌。本发明通过引入高效UDP葡萄糖基转移酶突变体UGT73B6^MK，并对葡萄糖代谢途径进行优化，显著提高了红景天苷的产量。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用。

背景技术

红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物，至今已有1000多年的应用历史，具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用。除此之外，红景天还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。红景天的主要药用活性成分是红景天苷及其苷元酪醇。近年来，以红景天苷作为主要原料生产的药剂、饮料、食品以及化妆品等产品种类越来越多，其苷元酪醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对红景天苷及其苷元酪醇的关注程度不断提高。除红景天苷和酪醇外，红景天植物中还含有其它一些化学物质，例如，淫羊藿次苷D2。

红景天苷(Salidroside)具有以下特征：化学名称为2‐(4‐hydroxyphenyl)ethyl‐β‐D‐glucopyranoside，分子式为C14H20O7，分子量为300.304，CAS号为10338‐51‐9，结构式为淫羊藿次苷D2(Icariside D2)具有以下特征：化学名称为p‐(2‐hydroxyethyl)‐phenol‐D‐pyranoglucoside，分子式为C14H20O7，分子量为300.31，CAS号为38954‐02‐8，结构式为其苷元酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化学名称为4‐(2‐Hydroxyethyl)phenol，分子式为C8H10O2，分子量为138.164，CAS号为501‐94‐0，结构式为

目前，红景天苷的生产主要是对红景天植株进行化学提取。野生红景天生长条件恶劣，植被资源稀有，而且红景天苷的量很低，如现在最常用的高山红景天和大花红景天，其植株中红景天苷的量只有0.5％‐0.8％。人工栽培的红景天成本高而有效成分量低，达不到市场要求的标准。因而植物提取正面临严峻的现实。除植物提取外，化学合成、微生物转化及组织培养生产红景天苷也是研究热点。

明海泉以酪醇和溴代四乙酰葡萄糖为原料，以Ag₂CO₃为催化剂，成功合成了红景天苷(明海泉，红景天苷合成及药理作用，药学通讯，1986,21(6):373)。

王梦亮等以D‐葡萄糖和酪醇为底物，探索出了一种借助于微生物合成红景天苷的方法(王梦亮，张芳，刘滇生，微生物催化D‐葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天苷的初步研究，催化学报，2006,27(3):233‐236)。

在采用组织培养方式进行红景天苷的生物合成方面，研究成果最为成熟的是Wu等用致密愈伤组织体系进行的红景天苷高产出率培养条件的研究。从高山红景天的根、茎、叶、子叶等分离体得到的相应的几种愈伤组织，并对其生长速度、红景天苷量和培养繁殖条件进行筛选，确定了生成高产出率红景天苷的最佳条件，红景天苷最高收获率可达到干重57.72mg/g，为野生植株的5～10倍(Wu S,Zu Y,Wu M High yield production ofsalidroside in the suspension culture of Rhodiola sachalinensis[J]JBiotechnol,2003,106(1):331)。