[发明专利]一种体外扩增CD8+T细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤过继性免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种能够特异扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TumorInfiltratingLymphocyte,TIL)中CD8⁺T细胞的方法。

背景技术

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)最初是由Rosenberg等研究者从小鼠肿瘤组织中发现和分离的一类具有肿瘤抗原特异性细胞群，这类群细胞以CD4⁺、CD8⁺T细胞为主，同时还包含少量NK和NKT细胞。TIL细胞由其具有特异性肿瘤细胞杀伤功能而被应用于抗肿瘤治疗研究当中，行使杀伤功能的主要效应细胞由CD8⁺T细胞组成。虽然TIL细胞治疗技术已经进入临床应用，对鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、淋巴癌、黑素癌等晚期癌症有一定疗效，但TIL细胞的大规模扩增难、抑制性Treg细胞比例较高等问题限制了其在临床肿瘤治疗上的广泛应用。因此，解决以上技术限制是本专利发明主要目的。

目前临床应用的TIL细胞扩增技术通常是采用IL-2、CD3单克隆抗体作为诱导剂活化和扩增CD8⁺T细胞，为满足临床用量，常规技术加入高剂量的IL-2，但是高剂量IL-2会对患者产生毒性作用，也可刺激TIL中CD4⁺CD25⁺Treg细胞增殖，从而抑制CD8⁺T细胞的增殖与杀伤作用。PD-1是程序性死亡分子，与其配体PD-L1结合后，可抑制淋巴细胞功能。研究表明，多数肿瘤浸润CD8⁺T淋巴细胞表面表达PD-1分子，其与肿瘤细胞表面高表达PD-L1结合后，可诱导活化CD8⁺T淋巴细胞凋亡，抑制其产生细胞因子和颗粒酶，进而减弱CD8⁺T淋巴细胞对肿瘤的杀伤作用，最终导致肿瘤发生免疫逃逸。另一方面PD-1和PD-L1结合能够诱导Treg细胞分化，促进其分泌IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子而抑制免疫应答。

发明内容

为了解决现有CD8⁺T细胞增殖与杀伤功能受抑制的问题，本发明提供一种有效的、简便的扩增CD8⁺T细胞的方法，采用癌性胸腹水来源提取TIL细胞，经过体外多种细胞因子刺激，获得大量具有较强杀伤能力的TIL细胞，提高了CD8+T细胞增殖与杀伤作用，同时抑制CD4⁺CD25⁺Treg细胞增殖，减弱其免疫抑制作用，提高TIL细胞抗肿瘤作用。

为实现发明目的，本发明采取的技术方案为：

一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，包括从癌性胸腹水来源提取得到TIL细胞，向TIL细胞培养液中添加细胞因子IL-2、CD3McAb和抗PD-1单克隆抗体。

作为优选，所述的IL-2浓度为300-1000U/ml，CD3McAb浓度为10-50ng/ml，抗PD-1单克隆抗体50-200ng/ml。

经研究发现，利用抗PD-1单抗封闭活化的CD8⁺T细胞表面的PD-1分子，能有效抑制PD-1和PD-L1结合产生的免疫抑制信号，另外也可促进CD8⁺T细胞扩增，加强细胞因子和颗粒酶分泌，提高对肿瘤细胞杀伤能力。本发明将抗PD-1单抗添加至TIL细胞培养过程中，以获得扩增倍数大、细胞杀伤效果强的TIL细胞。

更具体的，本发明关于一种体外扩增CD8⁺T细胞的方法，包括如下步骤：

(1)获取肿瘤细胞和TIL细胞混合体：

准备无菌肝素抗凝的抗凝瓶，从患者体内抽取胸腔积液或腹水，离心，弃上清液，生理盐水洗涤重悬。

(2)TIL细胞的分离：

细胞贴壁培养：

往步骤(1)获得的重悬细胞中缓慢加入100％淋巴分离液分离得到肿瘤细胞与TIL细胞混合体，生理盐水重悬细胞，离心收集细胞；收集得到的细胞用无血清培养液稀释至细胞浓度为5×10⁵-2×10⁶/ml，放置37℃、5％CO2培养箱培养，24小时后取出，将所得的TIL悬浮细胞移至另一培养瓶；或采用

非连续密度梯度培养：

对步骤(1)获得的重悬细胞采用非连续密度梯度离心法进行离心，从下往上依次加入100％淋巴细胞分离液、75％淋巴细胞分离液、去除上清液的胸腹水，经离心后，吸取100％淋巴细胞分离液界面TIL细胞，离心，弃上清，生理盐水洗涤重悬。