[发明专利]检测二氯喹啉酸的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测二氯喹啉酸的酶联免疫试剂盒及其应用，可定性、定量检测土壤中二氯喹啉酸的残留量。

背景技术

二氯喹啉酸是由德国巴斯夫公司开发的新型喹啉酸类激素型除草剂，具有选择性强和持效期长的特点。二氯喹啉酸在一年生杂草和禾本科作物之间有明显的选择性，可用于秧前和秧后的水稻田或直播水稻田的杂草防除，是我国稻田主要除草剂品种之一。由于二氯喹啉酸显酸性，在酸性土壤中降解缓慢，容易给后茬敏感作物造成严重危害，特别在水稻与烟草轮作地区，可造成烟草生长畸形。伴随二氯喹啉酸应用量的逐年增长，应用范围的逐年扩大，由于不合理的使用而导致农作物产生药害的事件也常有发生。在实际应用中，水稻田施用二氯喹啉酸后，经过半年的降解，二氯喹啉酸仍会有相当累积。水稻田施用二氯喹啉酸后的近300天内，除水稻外，不能种植任何作物；两年内不能种植烟草、茄子、番茄、胡萝卜、芹菜等作物，不能用施过二氯喹啉酸的水灌上述作物。为了缓解因土壤残留二氯喹啉酸而致烟草畸形生长，减少由此而造成的经济损失，种植前检测植烟土壤中二氯喹啉酸的含量显得尤为重要。

目前常用的二氯喹啉酸检测方法主要是仪器方法，如高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法，采用这些分析方法需要昂贵的仪器和专门的技术人员，样品前处理过程复杂且花费高、费时长，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种不受检测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术状况而提供一种能够检测土壤中二氯喹啉酸残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法，应用本发明的酶联免疫法测定土壤中二氯喹啉酸的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，易于推广等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的试剂盒包括：包被有包被原的酶标板、二氯喹啉酸标准品溶液、二氯喹啉酸抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为二氯喹啉酸偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的二氯喹啉酸抗抗体，所述二氯喹啉酸偶联抗原是由二氯喹啉酸半抗原与载体蛋白偶联得到，所述二氯喹啉酸半抗原是由二氯喹啉酸与溴乙酰氯反应得到，二氯喹啉酸半抗原分子结构式为：

。

所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述二氯喹啉酸抗体是以二氯喹啉酸偶联抗原作为免疫原制备获得，所述二氯喹啉酸抗体为二氯喹啉酸单克隆抗体或二氯喹啉酸多克隆抗体，其中优选二氯喹啉酸单克隆抗体。

所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标二抗是由酶和二氯喹啉酸抗抗体偶联得到的。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1~2 mol/L的硫酸溶液或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1~2 mol/L氢氧化钠溶液。

所述二氯喹啉酸标准品溶液6瓶，浓度分别为0 µg/L、0.5 µg/L，1.5 µg/L，4.5 µg/L，13.5 µg/L，40.5 µg/L。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01‰~0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1~0.3 mol/L的磷酸盐缓冲液，其中的百分比为重量体积百分比，单位g/mL。

所述复溶液优选为pH值为7.0、0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20 μg/mL，每孔加入100 μL，25℃避光孵育2 h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入150~200 μL封闭液，25℃避光孵育1~2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

其中，在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1~7.5，含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0.1~0.3 mol/L的磷酸盐缓冲液。

本发明的检测原理为：