[发明专利]一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。

背景技术

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)是近年在中国南方稻区新发现的由白背飞虱传播的一种新水稻病毒，它引起的南方水稻黑条矮缩病在我国造成了巨大的经济损失。SRBSDV自2001年首次在广东阳西县发现后，为害日趋严重。90年代以后，杂交水稻种植面积的大幅度增加和吡虫啉的大范围高强度施用，使白背飞虱逐渐取代褐飞虱而成为优势种群，导致近年来我国南方大部分稻区白背飞虱和SRBSDV连年爆发。2008年南方水稻黑条矮缩病毒病扩散至长江流域，2009年该病毒病在我国的发生面积约40万hm²，晚稻严重受害，超过0.67万hm²水稻基本失收。2010年该病害在我国广西、广东、江西、湖南、福建、贵州、云南、浙江、安徽、海南等13个南部省(区)爆发成灾。

SRBSDV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的一个新种，病毒粒体呈球状，直径70-75nm。病毒基因组为双链RNA(dsRNA)，共10个片段，由大到小分别命名为S1-S10，其中S10编码病毒的外壳蛋白。水稻的各个生育期均可受到SRBSDV侵染，但不同生育期的稻株感病后表现症状有所不同：初期感病的稻株明显矮缩，叶色深绿，上部叶的叶面可见凹凸不平的皱褶，拔节期地上数节节部有气生须根及高节位分枝，病株茎秆表面有乳白色大 小约1-2mm的瘤状突起，瘤突呈蜡点状纵向排列成一短条形，早期乳白色，后期褐黑色，不抽穗或仅抽包颈穗；分蘖期和拔节期感病稻株矮缩不明显、能抽穗，但穗型小、实粒少、粒重轻。南方水稻黑条矮缩病毒由白背飞虱介体传毒，病毒可在白背飞虱体内繁殖，白背飞虱一旦获毒，即终身带毒，若虫及成虫均能传毒，且白背飞虱高效传毒，水稻病株上扩繁的二代高龄若虫可90％带毒。但该病毒不能经卵传播，植株间也不互相传毒。

近年来我国南方水稻黑条矮缩病毒病发生处于上升时期，爆发态势仍将延续，而简便、快速、准确的检测技术对于强化我国南方水稻黑条矮缩病的诊断及其预测预警和科学防控尤为重要。目前一般采用田间观测、RT-PCR检测、电镜观察和dot-ELISA血清学方法来检测该病毒，田间观测准确性低，RT-PCR和电镜观察均需要精密仪器和专业的操作人员，只有dot-ELISA血清学方法适用于田间大批量样品的检测，但其耗时较长，而胶体金免疫试纸条操作简单、不用任何仪器、完成样品检测仅需5min，检测结果用肉眼观察判断，更适于基层推广应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。

快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条的免疫胶体金垫采用吸附有胶体金标记单抗的聚酯膜，所述的单抗由保藏号为CGMCC No.12006的15G6杂交瘤细胞株分泌；硝酸纤维素膜的检测线即T线上结合有保藏号为CGMCC No.5535的3F1细胞株分泌的单抗，质控线即C线上结合有羊抗鼠IgG。

南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条能准确、特异、灵敏地检测水稻、玉米和白背飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，且其检测水稻病叶的灵敏度达 到1:5,120倍稀释(w/v,g/mL)，检测单头携毒白背飞虱的灵敏度达到1:51.2倍稀释(头/mL)。

南方水稻黑条矮缩病毒胶体金免疫试纸条检测感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻、玉米和白背飞虱样品呈强阳性结果，而检测感染水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染甘蔗花叶病毒、玉米褪绿斑驳病毒的玉米和健康玉米均呈阴性结果。

快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法的步骤：

1)南方水稻黑条矮缩病毒单抗的制备：用感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻粗提液为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆获得1株能稳定传代并分泌抗SRBSDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株15G6，其保藏号为CGMCC No.12006，该杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔，制备单抗腹水；

2)胶体金溶液制备：将100mL 0.01％氯金酸加热沸腾，加入1mL 1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾25min，氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；