[发明专利]茶树snRNA U6基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及茶树snRNAU6基因及其应用。

背景技术

snRNA是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(Spliceosome)的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。snRNAU6在很多方面与其他snRNA不同。snRNAU6在不同物种间保守性都高于其他已知的snRNA。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监控整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便性，在许多领域有着广泛的应用。运用实时定量荧光PCR(qRT-PCR)检测基因表达量的一个重要的前提是必须有一个稳定表达的基因作为内参。snRNAU6在真核生物各种组织和细胞中广泛表达，而且表达水平相对稳定，因此，常被选作内参基因用于microRNA的定量表达分析。

Northernblot杂交技术是一种监测和定量miRNA在植物中表达水平的标准方法，其基本原理是首先在载体(如玻片或尼龙膜)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针,然后与经过标记的样本miRNA杂交，进行信号检测。因其灵敏度高，特异性好而被广泛应用到验证miRNA定量检测中。snRNAU6在Northernblot杂交过程中也展现了表达稳定的特性，因此也常被选作内参基因用于Northernblot杂交中。

发明内容

本发明的目的是提供可作为茶树miRNA定量表达分析的内参基因的茶树snRNAU6基因及其应用。

为了实现本发明目的，本发明根据NCBI数据库中已公布的植物的snRNAU6cDNA序列，进行同源性比对，筛选出高度保守的snRNAU6序列(与玉米、扁豆、土豆等植物的U6基因进行同源对比，结果显示该基因在不同物种中高度保守，同源性高达96.67％，图1)。利用RACE技术获得茶树snRNAU6基因全长，其cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

本发明还提供所述基因作为茶树miRNA定量表达分析的内参基因中的应用，内参基因的作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

本发明还提供根据所述基因设计的用于基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法中的内参引物，内参引物序列如下：

F:5′-CGGGGACATCCGATAAAATTG-3′

R:5′-GGACCATTTCTCGATTTGTGC-3′

本发明还提供含有所述引物的用于基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法的检测试剂盒。所述试剂盒中还包括反转录酶M-MLV、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。

本发明还提供所述基因作为相对定量中的内参基因在实时荧光定量PCR的茶树microRNA表达分析中的应用。

本发明还提供根据所述基因设计的用于基于Northernblot技术的miRNA相对定量法中的杂交探针，探针序列如下：5'-GGGCCATGCTAATCTTCTCTGTATCGTT-3'。优选为地高辛标记探针。

本发明进一步提供所述基因作为相对定量中的内参基因在基于Northernblot技术的茶树microRNA表达分析中的应用。

本发明首次克隆获得了茶树snRNAU6基因的cDNA序列，设计了荧光定量PCR引物以及Northernblot地高辛探针，采用qRT-PCR法对茶树不同处理的microRNA(miRNA)进行内参基因筛选，使用geNorm内参筛选软件对候选内参基因U6进行分析，并用Northernblot杂交验证其在茶树的不同器官、不同叶位和不同处理中均可稳定表达。从而证明了茶树snRNAU6基因的表达水平不受不同器官、不同叶位和不同处理的影响，符合作为内参基因的基本特征，可作为茶树microRNA表达分析的内参基因。

本发明具有以下优点：

(一)本发明提供的方法适用于茶树miRNA的表达分析，操作相对简单，成本较低，灵敏度高。

(二)本发明克隆获得了茶树snRNAU6基因全序列，可用于miRNAqRT-PCR的定量表达分析的内参基因。通过geNorm软件分析，snRNAU6基因的M值小于1.5，从而旁证了U6基因适合作为miRNA表达分析的内参。