[发明专利]PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用

权利要求书

1.一种PD-1基因重组病毒质粒，属逆转录病毒质粒，命名为慢病毒载体KGEN-0626，于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201601，其序列为SEQ ID NO：1。

2.权利要求1所述PD-1基因重组病毒质粒的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)使用EcoR1和Age1核酸内切酶和磷酸酶37℃处理30分钟去磷酸化Lenti-CRISPR/Cas9质粒；

2)以PD-1基因序列中2859-2878位的共20个碱基序列CACGAAGCTCTCCGATGTGT作为PD-1gRNA，在T4连接酶的作用下将PD-1gRNA引物序列与其互补的链经37℃孵育30分钟，95℃孵育5分钟，再以每分钟5℃的速度降温至25℃的条件退火合成PD-1双链DNA；

3)使用快速核酸连接酶将PD-1双链DNA与去磷酸化的Lenti-CRISPR/Cas9质粒连接，室温孵育10分钟即可得到重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。

3.一种重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro，其特征在于，包含有权利要求1所述的或者由权利要求2得到的PD-1基因重组病毒质粒。

4.权利要求3所述重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro的包装方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)将重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro转入Stbl3细菌，经氨苄青霉素筛选，扩增，纯化，测序；

2)转染前一天种293T细胞到10cm培养皿，细胞密度第二天长到细胞80％汇合；培养基为DMEM含10％胎牛血清、5000U的抗生素；

3)转染前2小时换新鲜培养基，将PD-1重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro与质粒pSPAX、pMD2.G转染试剂混合到1.5ml离心管中；

4)将混合液轻轻混匀后室温放置10分钟后加入10ml细胞培养基中，轻摇混匀；

5)37℃，5％CO2细胞培养箱培养6小时后，更换新鲜培养基；

6)培养48小时后收集富含病毒的培养基，用0.45um的滤器过滤后分装保存于-80度，或直接用于感染T细胞。

5.权利要求3所述的或者由权利要求4得到的重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro在制备用于治疗肿瘤细胞的免疫治疗体系中的应用。