[发明专利]病毒载体颗粒及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种病毒载体颗粒及其构建方法和在治疗人类慢性疼痛药物中的应用。该病毒载体颗粒包括pspax2、pmd2.G和pwpi质粒，所述pwpi质粒包含启动子、肉毒素酶活区以及内部核糖体进入位点序列。该病毒载体颗粒的构建方法包括（1）细胞系 lenti‑x293T的培养；（2）换成DMEM培养基；（3）将pspax2、pmd2.G和pwpi质粒转染到lenti‑x293T细胞；（4）洗掉转染液，加入含10wt%小牛血清的培养液进行培养；（5）回收培养液，过滤、离心，即可获得高滴度的病毒载体颗粒。本发明病毒载体颗粒对治疗慢性疼痛更有针对性，可以阻止神经系统和外周细胞之间的恶性循环。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种病毒载体颗粒及其构建方法和在治疗人类慢性疼痛药物中的应用。

背景技术

疼痛是对于实际的或潜在的损害产生的一种不愉快的感觉和情感体验，是一个复杂的感性经验，包括传达感官信息的nociceptors（疼痛感受器）对于如位置、类型和强度的刺激产生的反应。一直以来疼痛及其治疗被视为重要和有趣的医学领域。

慢性疼痛是组织所造成的伤害，很多时候伴有神经的长期损伤 。慢性疼痛是由于激活了nociceptors (疼痛接收器) 导致nociception (神经处理有害刺激)，疼痛的感觉开始于神经传入。中枢系统也发挥了作用，从而维持疼痛的持久性。

神经和免疫系统是链接外围炎症反应之间的一个重要环节。细胞因子在没有人身伤害或损坏的情况下可以触发疼痛，促进炎症，细胞因子的产生水平升高在大脑和脊髓的外围神经系统 (感官神经细胞) 造成损害。在外周神经受到伤害后，免疫反应在背根Ganglia (DRGs) 由macrophages（巨噬细胞）、淋巴细胞和卫星细胞产生。因痛觉感受神经元释放痛觉递质 (P物质、CGRP和激素产生的基因相关肽) 从而刺激免疫细胞，如macrophages（巨噬细胞）、synoviocytes（滑膜细胞）导致分泌炎性细胞因子，如TNF-α和IL-6。另一方面，neurodegeneration（神经退行性变）造成痛觉多肽P物质和降钙素CGRP等刺激免疫细胞释放细胞因子。总之，神经系统和外周炎症细胞建立了一个恶性循环的过程。

目前治疗急性和慢性疼痛依靠三大类的止痛药物：nonsteroidal抗炎药物(NSAIDs)、阿片类药物和adjuvants(抗抑郁药、抗痉挛药、当地麻醉气体、2-adrenoceptor「一种促效剂」)。NSAIDs和阿片类药物过度使用会产生副作用 (恶心、呕吐、胃粘膜溃疡、肾功能衰竭、肝功能衰竭、呼吸抑制、咳嗽抑制等)，甚至涉及神经伤害。所以通常需要进行剂量滴定直到足够剂量但又不会产生疼痛或不可容忍的副作用。令人遗憾的是，第二种结果常常发生所以必须终止治疗，结果是只有部分程度的疼痛能被消除。

近年来，由于肉毒素的特异性切割SNARE蛋白并抑制过度的痛觉和炎症因子分泌，已成功应用到治疗疾病。根据肉毒素的血清型共分为7类，A-G，每一类都拥有独一无二的特点，它们会选择性地切割各自的SNARE 蛋白底物，比如SNAP-25（突触小体相关蛋白）能被肉毒素A/C1/E型所切割、syntaxin1（突触融合蛋白）被肉毒素C1型、synaptobrevin（小突触泡蛋白）能被肉毒素B/D/F和/G型 所切割(表1)。

表1 肉毒素的血清型和切割位点

目前，小剂量的肉毒素已被成功用作化妆品和骨关节肌肉病治疗，其持续作用时间较长（6个月以上），副作用小。近年来临床上又被用于偏头痛/张力头痛和肌肉疼痛综合症软组织疼痛的综合症等，注射3个月的患者还仍能起到镇痛作用。