[发明专利]一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用

说明书

本发明公开了一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的Cronobacter sakazakii突变株的ESA‑03574基因片段进行敲除，使Cronobacter sakazakii菌株对阳离子抗菌肽抗性显著降低、更容易被抗菌肽杀死，本发明的Cronobacter sakazakii突变株细胞激活TLR4免疫通路的能力减弱，对细胞毒性减弱，有利于疫苗佐剂的开发。

技术领域

本发明涉及一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种自然界中广泛存在的食源性革兰氏阴性致病菌，主要污染婴儿配方奶粉。它可以引起新生儿脑膜炎、败血病、菌血症及坏死性小肠结膜炎等疾病。近些年的研究表明，有些革兰氏阴性菌的致病能力与其外膜类脂A的分子结构密切相关，但关于阪崎克罗诺肠杆菌类脂A分子修饰及作用还有待研究。

细菌细胞膜表面的LPS并不是一个稳定的结构，细菌处于特定条件下是会对其结构进行不同的修饰，这些修饰赋予了细菌对抗菌剂的抗性，以及提升了入侵宿主的能力。PmrA-PmrB是一个二元调控系统，调控多种发生在LPS上的化学修饰，并且它可以在多种细菌物种内行使作用。PmrA-PmrB的修饰作用可以增强细菌对阳离子抗菌肽粘菌素的抗性以及细菌在巨噬细胞中的复制能力。同时，PmrA-PmrB二元调控系统还对细胞的生命活动有着整体的影响，可以影响细菌的毒性。

疫苗佐剂(Vaccine adjuvant)，又称免疫增强剂(Immunomodulator)，是在疫苗接种过程中辅助疫苗作用、改善或增强疫苗作用效果的一类物质。免疫佐剂需具备有效激起非特异性免疫反应，增强机体对某疫苗的免疫原性或保护性应答的能力。

如何降低菌株毒性以便制备疫苗佐剂是目前亟需解决的问题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供C.sakazakii的类脂A分子中修饰相关的基因工程菌，检测该修饰对菌株的影响。

本发明的第一个目的是提供一种Cronobacter sakazakii的基因工程菌，所述基因工程菌缺失了ESA-03574基因片段。

在本发明的一种实施方式，所述ESA-03574基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO:1的序列。

在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌为无抗性C.sakazakii BAA894△ESA-03574，以Cronobacter sakazakii BAA894为出发菌、缺失了核苷酸序列为SEQ ID NO:1的ESA-03574基因片段。

在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌的构建方法如下：将人工构建的ESA-03574敲除片段电转化入含pKD46质粒的C.sakazakii BAA894，获得突变株C.sakazakiiBAA894ΔESA-03574-loxPkan，再化转入pKD-Cre质粒(参考文献：Yaning Han,Construction of Monophosphoryl Lipid A Producing Escherichia coli Mutants andComparison of Immuno-Stimulatory Activities ofTheir Lipopolysaccharides,Marine Drugs,2013,11,363-376)，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pKD-Cre质粒后获得无抗性lipidA的基因结构突变的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式，所述ESA-03574敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。