[发明专利]一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的检测方法

权利要求书

1.一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的检测方法，其特征在于利用经典巯基自组装的方式将能够与PARP特异结合的单链DNA即c-kit-1修饰于金电极表面，经处理使c-kit-1形成四聚体构型；与PARP孵育后，加入该酶特定的催化底物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，促使PARP发生自催化产生一条带有高负电荷的聚腺苷二磷酸核糖(PAR)；利用PAR的负电荷吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex)，利用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，即可实现PARP及其抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的灵敏检测。

2.根据权利要求1所述的PARP的检测方法，其特征是利用经典巯基自组装的方式将c-kit-1修饰于金电极表面，经处理使c-kit-1形成四聚体构型，该修饰过程，首先将经过经典方法预处理的金电极浸泡于100μL含0.2μM c-kit-1的10mM Tris-HCl，10mM TCEP，0.1MNaCl固定溶液，溶液pH值为7.4，室温孵育12小时，再将该电极浸泡于1mM巯基己醇溶液1小时，之后用蒸馏水冲洗，再将电极浸泡于100μL含50mM Tris-HCl，100mM KCl的四聚体形成溶液，溶液pH值为7.4，放置于95℃孵育5分钟后，缓慢冷却至室温，时间约为6小时，促使c-kit-1形成四聚体构型。

3.根据权利要求1所述的PARP的检测方法，其特征是c-kit-1修饰的金电极与PARP孵育后，加入该酶特定的催化底物NAD，促使PARP自催化产生一条带有高负电荷的PAR，权利要求2中c-kit-1修饰的金电极与100μL含不同浓度的PARP的50mM Tris-HCl，50mM KCl，2mMMgCl₂，50μM Zn(OAc)₂反应溶液，溶液pH值为7.4，25℃孵育1小时，再将电极浸泡于100μL含有500μMNAD反应溶液中，25℃孵育1小时。

4.根据权利要求1所述的PARP的检测方法，其特征是利用PAR的负电荷吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex)，利用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，通过电信号与PARP浓度的关系，即可实现PARP酶活性的灵敏检测，将经过权利要求3处理的电极置于5mL含5μM RuHex的10mM Tris-HCl缓冲溶液中，溶液pH值为7.4，进行电化学定量分析，其扫描方法为方波伏安法，参数设置：初始电位-0.5V，终止电位-0.2V，电位增量0.004V，振幅0.025V，频率30Hz。