[发明专利]HAV病毒样颗粒的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有甲肝病毒HAV5’-UTR基因的病毒样颗粒的制备方法及应用。

背景技术

甲型肝炎病毒是1973年Feinslone首先用免疫电镜技术在急性期患者的粪便中发 现甲型肝炎病毒(HapatitisAvirus，HAV)。属微小RNA病毒科，新型肠道病毒72型，是 一种常见的食源性疾病病毒，HAV对外界抵抗力较强，耐酸碱，室温下可生存1周，干粪中25 ℃能生存30天。人类感染HAV后，大多表现为亚临床或隐性感染，少数人表现为急性甲型肝 炎，严重危害人民群众健康。甲肝病毒呈全世界分布，我国作为高发区之一，其发病率十分 高。甲肝病毒主要通过食物传播，当人们生食含有甲肝病毒的食物时，极有可能因感染病毒 而诱发甲型肝炎。美国曾经出现因食用冻草莓引起的甲肝暴发事件。因此，食品中甲肝病毒 的快速检测对于保障公共卫生安全非常重要。

目前，食品中HAV检测的常用方法有RT-PCR技术和荧光定量RT-PCR技术，为了保 证检测的准确性，实验中必须设立阳性对照或质控品。通常使用病毒培养物或是由RNA逆转 录得到的cDNA做标准品，但是前者存在生物安全的隐患且易被核糖核酸酶降解，后者不能 体现核酸提取过程和反转录对试验的影响。本发明采用ArmoredRNA技术，构建包裹甲肝病 毒基因的假病毒标准样品，此假病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控 品可以对从核酸提取至RT-PCR检测的全过程进行有效的监控。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：构建包裹甲肝病毒基因的假病毒标准样品，此假 病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控品可以对从核酸提取至RT-PCR 检测的全过程进行有效的监控。

本发明为解决上述技术问题，将编码组氨酸标签序列插入MS2噬菌体编码外壳蛋 白的β发夹环结构序列中，构建含有重组组氨酸标签的MS2噬菌体外壳蛋白和表达成熟酶蛋 白基因的pNH-MS2his重组质粒。并通过RT-RCR技术扩增HAV基因，将其克隆于pNH-MS2his 中，构建原核重组表达质粒pNH-MS2his-HAV。并将其转化于表达大肠杆菌BL21(DE3)中进行 诱导表达。结果表明，表达的重组蛋白能够自主装配形成VLPs，而且其中含有HAV的基因RNA 序列，并且该RNA序列具有良好的稳定性，可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品用于 临床及样品检测。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明设计了一组扩增HAV5’-UTR基因引物，序列如下：

HAV-UTRf1：ATACCTCACCGCCGTTTGCCTAGGCTA；

HAV-UTRr1：AAGAATGAGGAAAAACCTAAATGCC；

5‘端和3’端分别加上HindIII和NotI酶切位点。

本发明提供一种pNH-MS2his重组质粒，pNH-MS2his重组质粒中插入的的HAV5’- UTR基因片段序列如下：