[发明专利]检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试 剂盒，适于E种肠道病毒感染的诊断及组织或细胞中牛肠道病毒抗原的定位与鉴定。

背景技术

牛肠道病毒（Bovineenterovirus,BEV）包括E、F两个病毒种，属于小RNA病毒科 肠道病毒属中的成员，它所引起的传染病给养牛业造成严重经济损失。该病毒感染以临床 上发热、流泪、咳嗽、流鼻涕、呼吸困难和严重腹泻为主要特征。本病于上世纪50年代后期由 Moll等首次报道，之后许多国家也相继报道本病的发生。国内李英利等于2011年从内蒙某 奶牛场的犊牛粪便样品中分离到一株F种肠道病毒。申请人从吉林省暴发的临床上以呼吸 道和消化道症状为主要特征的疫病中，分离鉴定出一种新的肠道病毒：E种肠道病毒。E种肠 道病毒感染在国内为新发传染病，严重危害养牛业的健康发展，其诊断与防治缺乏研究。

发明内容

本发明提供一种检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒。

检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂，是用FITC标记的VP1单克隆抗体。所述的VP1单 克隆抗体，是利用E种肠道病毒的VP1蛋白，采用杂交瘤单抗制备技术获得；

所述的VP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。

所述的VP1蛋白为是由碱基序列如序列表SEQIDNO.1所示的E种肠道病毒基因 VP1表达的。

所述的E种肠道病毒基因VP1为人工合成。

E种肠道病毒直接免疫荧光检测试剂盒，免疫荧光试剂为上述检测E种肠道病毒的 免疫荧光试剂。

本发明提供了检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒，是应用本发明 的检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂，试剂建立的直接免疫荧光检测方法，既可用于临床快 速诊断E种肠道病毒感染，也可用于E种肠道病毒抗原在组织中的定位与鉴定。直接免疫荧 光检测时间短，40分钟内即可报告结果；特异性强，仅与E种肠道病毒反应；重复性好，准确 性高，与间接免疫荧光方法的符合率为90%以上，可用于E种肠道病毒感染的快速诊断。

本发明的优点

1、应用本发明试剂建立的直接免疫荧光方法，可用于临床快速诊断E种肠道病毒感染， 也可用于E种肠道病毒抗原在组织细胞中的定位与鉴定；

2、直接免疫荧光方法特异性强、灵敏度高、具有很好的重复性。40分钟内报告结果，可 用于E种肠道病毒的快速诊断；

3、具有生物安全性,试剂盒所用的抗E种肠道病毒VP1的单克隆抗体为原核载体表达的 重组蛋白诱导BALB/c小鼠产生，不含活的肠道病毒，因此不存在散毒危险；

4、敏感性高。制备单克隆抗体具有很高的免疫效价，从而确保异硫氰酸荧光素(FITC) 标记后试剂的敏感性；

5、特异性强。制备的免疫荧光试剂与其他病原体无交叉反应，只检出E种肠道病毒，具 有很高特异性；

6、稳定性好,荧光试剂4℃保存6个月，检测结果与常规方法无明显差异，具有很好的稳 定性。

附图说明

图1pGEX-4T-1-VP1重组质粒酶切鉴定（泳道2、3：pGEX-4T-1-VP1；泳道1：pGEX- 4T-1质粒阴性对照；泳道4：DNA分子marker）；

图2重组VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果（泳道3：pGEX-4T-1-VP1重组菌未诱导总蛋白； 泳道2：pGEX-4T-1-VP1重组菌诱导后总蛋白；泳道1：蛋白分子marker）；

图3纯化重组VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果；

图4杂交瘤细胞染色体计数；

图5直接免疫荧光检测结果。

具体实施方式

实施例1E种肠道病毒结构蛋白VP1原核表达重组质粒的构建

1、引物设计

根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增VP1基因的引物，上下游分别含有BamHI、 EcoRI酶切位点。引物序列如下：

E-VP1-FCGCGGATCCGAAACAAGCGTGGAGA（BamHI）

E-VP1-RCCGGAATTCGTACGAGGTGAGGCT（EcoRI）

2、基因扩增