[发明专利]一种固定化马来酸顺反异构酶及其制备方法与应用有效
| 申请号： | 201510364026.9 | 申请日： | 2015-06-26 |
| 公开（公告）号： | CN104962571B | 公开（公告）日： | 2018-08-21 |
| 发明（设计）人： | 周哲敏;刘文茂;周丽;崔文璟;刘中美 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N9/90;C12N11/04;C12P7/46;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙) 11419 | 代理人： | 张勇 |
| 地址： | 214122 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 固定 马来 顺反异构 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种固定化马来酸顺反异构酶的制备方法，其特征在于，在马来酸顺反异构酶的N端融合SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的R5短肽，所得重组酶与交联剂交联获得交联酶聚集体，再与硅化反应液、正硅酸甲酯混合剧烈搅拌，得到固定化酶，所述马来酸顺反异构酶来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，所述交联剂为10％的戊二醛，所述硅化反应液是pH＝8的含0.1M磷酸氢二钾和0.1M氢氧化钠的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以pET24a为载体，重组表达获得N端融合有R5短肽的重组马来酸顺反异构酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以pET24a为载体，构建重组表达N端融合有R5短肽的重组马来酸顺反异构酶的重组菌，培养收集重组菌并破壁后，上清液经硫酸铵沉淀后用于制备固定化酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，交联酶聚集体与硅化反应液、正硅酸甲酯按体积比1:8:1混合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1 ：将 R5 短肽与马来酸顺反异构酶N端连接，并构建表达融合蛋白R5-MaiA的工程菌株 ；
步骤2：取步骤1工程菌的发酵液离心去上清后获得菌体，用缓冲液清洗菌体并调整菌液OD600＝30-40，超声波破碎后离心取上清；
步骤3：取步骤 2 获得的上清，在搅拌的情况下缓慢加入硫酸铵粉末，直到饱和度达到60％，继续搅拌使马来酸顺反异构酶沉淀；
步骤4：步 骤3完成后，向体系中逐滴加入10％的戊二醛至体积终浓度为0.05％-0.2％并于室温下不断搅拌1h，得到交联酶聚集体；
步骤5：将步骤4获得的交联酶聚集体离心，得到不溶于水的颗粒并用pH 8.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液洗涤三次；
步骤6：步骤5的交联酶聚集体与硅化反应液、正硅酸甲酯混合剧烈搅拌30s，静置离心后，用缓冲液洗涤得到固定化酶，所述硅化反应液是pH＝8的含0.1M磷酸氢二钾和0.1M氢氧化钠的溶液。
6.根据权利要求1所述方法制备得到的固定化马来酸顺反异构酶。
7.权利要求6所述固定化马来酸顺反异构酶在制备富马酸中的应用。
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