[发明专利]一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶标蛋白

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶标蛋白。

背景技术

弓形虫是一种世界范围内寄生的原虫，可导致人畜流产、死胎和免疫抑制患者死亡，其临床表现复杂，确诊困难，给公共卫生和畜牧业带来极大危害。在过去，免疫学检测方法是弓形虫病的主要检测方法，但是抗弓形虫IgG的检测难以区分急性感染和既往感染，IgM和IgA阳性也不能作为急性感染的标志。因此，弓形虫急性感染的早期检测标志物有待进一步寻找确定。

弓形虫循环抗原(Circulating Antigens，CAg)是弓形虫急性感染期虫体自身排泄和裂解产物，动物感染弓形虫1-2天即可检出CAg，2周后滴度显著降低，CAg阳性提示弓形虫病急性、活动性感染，是病原体存在的重要标志，是早期感染的可靠指标。排泄-分泌抗原(Excretory/Secretory Antigens，ESA)为CAg的主要成分，现有研究大多是提取ESA抗原或者表达某个分泌蛋白制备多抗来检测血清中的CAg，由于CAg抗原的含量较少，且成分复杂，从而使得这些方法的特异性、灵敏度有限。因此，目前尚缺少一种特异性和灵敏度都较高的检测弓形虫的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服了目前检测弓形虫感染的方法难以区分急性感染和既往感染、利用循环抗原来检测急性感染的方法因循环抗原含量低、成分复杂等原因特异性和灵敏度有限的问题，提供了一种适用于弓形虫早期急性感染检测的高特异性、高敏感性的检测方法，用所述检测方法能够快速检测弓形虫急性感染，并具有较高的特异性和灵敏度。

本发明技术方案之一：一种非疾病诊断治疗目的的检测弓形虫急性感染的方法，其包括下述步骤：使待检测样本与弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。

本发明中，所述待检测样本可以为本领域常规所指被弓形虫感染的样本，较佳地为被弓形虫感染后的血清样本。

本发明中，所述弓形虫ELMO蛋白可以为本领域常规所指，较佳地为氨基酸序列如GenBank收录号为EPT30320.1的序列所示，所述弓形虫ELMO蛋白的制备方法可以为本领域常规的方法，如合成法或表达纯化法，较佳地为原核表达纯化法。所述原核表达纯化方法较佳地包括下述步骤：培养含有所述弓形虫ELMO基因的原核表达载体的原核表达菌株，破碎细胞，从裂解液中提取所述弓形虫ELMO蛋白。所述原核表达的菌株可以为本领域常规的表达菌株，较佳地为大肠杆菌表达菌株，更佳地为大肠杆菌BL21菌株。所述原核表达的载体可以为本领域常规的表达载体，较佳地为pET系列表达载体，最佳地为pET28a载体。所述提取方法可以为本领域常规，较佳地为层析法，更佳地为亲和层析法，最佳地为镍离子-6组氨酸亲和层析法。

本发明中，所述弓形虫ELMO蛋白的抗体可以为本领域常规所指的抗体，如单克隆抗体或多克隆抗体。所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的制备方法可以为本领域常规的制备方法，较佳地包括下述步骤：将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述抗体，更佳地包括：将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物，二次免疫后采集血液分离含有所述抗体的血清。所述动物可以为本领域常规使用到的动物，较佳地为兔或小鼠，更佳地为小鼠。所述免疫注射可以为本领域常规的注射方式，如直接将所述弓形虫ELMO蛋白注射到动物体内，较佳地为将所述弓形虫ELMO蛋白与弗氏佐剂一起注射到所述动物体内。所述二次免疫的间隔时间较佳地为2周，所述采集血液较佳地为从所述动物的尾静脉采集。

本发明中，所述反应可以为本领域常规所指，较佳地包括下述步骤：(1)将所述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体包被于基质上；(2)向步骤(1)中包被有所述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的基质上加入待检测样本，使其与所述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。

本发明中，较佳地还可以包括步骤(3)：检测步骤(2)所述反应的结果。所述检测可以为本领域常规的检测方法，较佳地为检测抗原与抗体反应的检测方法，例如当基质上包被的为ELMO蛋白时，在步骤(2)过后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗IgG的抗体后孵育、显色并测定化学发光值；当基质上包被的是所述检测弓形虫急性感染的抗体时，在步骤(2)后加入与所述检测弓形虫急性感染的抗体异源的ELMO抗体，孵育后再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗IgG的抗体后再孵育、显色并测定化学发光值。