[发明专利]含聚电解质的核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于功能纳米材料技术领域，具体涉及一种富含聚电解质的核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质是生物体各种生理功能的调控者，也是生命现象最直接的体现者。对蛋白质的结构、功能进行系统的研究分析对于我们理解生物体系以及揭示生命体处于病理条件下的变化机制具有重要的意义，对于癌症等疾病的提早发现和诊治也具有至关重要的作用。在生物体中承担重要生命活动的蛋白往往都是低丰度蛋白，这些蛋白极低的含量给后续的分析和检测带来了很大的困难。因此将这些低丰度蛋白从复杂生物体系中选择性富集出来，然后再进行分析和鉴定成为了目前的研究热点。

磁性复合微球由于具有独特的磁响应性，可以在外加磁场下对复杂的生物体系进行微操作从而特别适用于蛋白质组学的研究。通过对磁性微球表面进行各种修饰能达到富集各种各样特定蛋白的目的。传统的使用磁性复合微球分离生物活性物质的方法是通过抗体-抗原的相互作用，即把抗体固定在磁性复合微球表面，然后特异性分离相应的抗原。虽然抗体-抗原作用的特异性很好，但是抗体的价格十分昂贵，而且只能特异性识别某一蛋白。而对于蛋白组学来说，往往需要的是富集所有或者某一类的蛋白或多肽。因此抗体-抗原作用并不是很适合。目前富集目标蛋白或多肽按目的性可以大致分为两类：一种是选择性的富集某一类有特殊修饰的蛋白或多肽，例如选择性富集His-tag标记的重组蛋白、选择性富集磷酸蛋白或磷酸肽、选择性富集糖蛋白或糖肽等；另一种是没有选择性的富集体系中的所有蛋白或多肽，其主要目的是要去除体系中干扰分析和检测的盐分及其它成分。第一种特异性的富集特别适用于已知生物标志物的富集检测并引起了广泛的关注，但是近年来随着对于癌症等疾病检测对于未知标志物发现要求的提高，在不知道标志物蛋白类型的情况下，非特异性富集全血中所有可能的标志蛋白显得尤为重要。

没有选择性的富集体系中的所有蛋白或多肽一般利用的都是疏水相互作用。所以用于此类应用的磁性复合微球表面应该为较疏水的物质。目前报道的有C8、C60、PMMA等。在这类材料强疏水性的帮助下，复合微球对于蛋白质的富集有较好的效果。但是由于疏水-疏水相互作用对于蛋白种类还是有一定的选择性，如更适用于疏水蛋白，所以在富集低丰度标志物的时候难免会漏掉一些亲水蛋白。且该类材料富集得到的蛋白大部分都要用有机溶剂洗脱，条件相对苛刻且洗脱效率和回收率均不高。对于实际操作过程，该类疏水材料往往在富集溶液中的分散性并不好且容易黏在管壁，故而其操作较繁琐且材料利用率也不高。

因此，需要寻求新的方法用于无选择性的富集生物体系中的蛋白，于是本发明提供了一种反离子蒸发的方法去富集。主要分两步，首先用该类磁性材料去除复杂实际样本如血清中的高丰度蛋白，然后继续利用该材料富集浓缩该体系中剩下的低丰度蛋白。该类材料主要是磁性材料外包覆聚电解质（如PAA（聚丙烯酸）），在水溶液中能够形成大量的反离子（如正离子），蛋白质不管其等电点如何通常由正电荷和负电荷两部分组成，其中的正电荷段就能够去置换聚电解质中带正电的反离子从而使得蛋白质被吸附，这是一个熵增的过程，故而是一种非常通用的方法，适用于不同分子量不同等电点的几乎所有蛋白质的富集。

发明内容

本发明的目的在于提出一种制备过程简单，表面官能团密度高，能大量富集各种各样蛋白的核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用。

本发明针对背景技术中所存在的问题，提出了能够高效富集和洗脱无论是高丰度还是低丰度蛋白的材料和方法。首先制备无机磁性纳米晶团簇，然后聚甲基丙烯酸羟乙酯作为内壳包覆到磁簇上去，接着在其外修饰一层RAFT试剂（S-1-十二烷基-S'-(α,α'-二甲基-α''-乙酸基)三硫酯），然后通过表面引发RAFT聚合方法制备得到核壳壳式磁性复合微球，记为Fe₃O₄/PHEMA-RAFT-PAA，由于该微球非常亲水且能在溶液中形成大量的正电荷反离子，蛋白都具有正电荷和负电荷部分，因而正电荷部分能够置换出之前提及的正电荷反离子，从而实现对于所有蛋白质的吸附。

本发明提出的富含聚电解质的核壳式磁性复合微球的制备方法，具体步骤为：

（1）首先，以六水合三氯化铁、醋酸盐和柠檬酸盐为原料制备柠檬酸盐稳定的磁性纳米粒子团簇（简称磁簇）；

（2）接着，使用溶胶凝胶法对磁簇表面进行修饰，使其表面带上活性的乙烯基官能团；