[实用新型]副鸡嗜血杆菌pyrG基因PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型属于生物技术领域，涉及副鸡禽杆菌pyrG基因检测试剂盒，是通过PCR技术扩增出939bp的基因片段，检测发病鸡群中病鸡的眶下窦分泌物中存在的副鸡嗜血杆菌的PCR检测试剂盒。 

背景技术

鸡传染性鼻炎(infectious coryza IC)是由副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum Hpg)引起的一种鸡的急性上呼吸道感染及毒素作用疾病。造成的最大损失是蛋鸡产蛋率的下降(10％-40％)及育成鸡和肉鸡的生长不良和淘汰率增加，给养鸡业造成了较大的经济损失。按Page的分型方法，可将副鸡嗜血杆菌分为A、B和C三个血清型，各血清型之间没有交叉保护，B型的免疫保护有一定的型特异性，所以了解病原的血清型分布可以更好的预防和控制本病。 

已采用的几种血清学方法中，血凝抑制试验几乎是早期诊断传染性鼻炎最合适的方法，三个血清型中有些共同抗原，所以用单一血清型制备的抗原仍有可能检出不同型的凝集素。HI抗体的产生晚于凝集抗体和琼扩抗体，所使用的HI抗原主要用于A血清型菌株的测定；C型菌株作HI试验时，抗原需用硫氰化钾处理，超声波裂解，红细胞需要用戊二醛处理稀释液为含0.1％牛血清白蛋白的PBS。但此法不适于早期感染或免疫鸡的抗体水平。 

目前比较成功的是DNA探针和PCR技术，陈小玲等于1996年从其建立的HpgDNA文库中筛选出了4个种特异性片断并用地高辛进行标记，可检测纯化DNA量均在7.8-31.25ug之间.通过对最小探针部分序列的测定，设计了两对PCR引物，建立了两种PCR诊断方法，在对41个Hpg分离株测定时，结果均为阳性，而对26个非Hpg的测定.结果均为阴性，并均能检测出Hpg的DNA10³-10³个菌细胞。该方法良好的特异性和敏感性使之可以用来直接检测Hpg，用于临床上直接样品的检测，从而提高了诊断的敏感性，但不能够应用于血清型的分类。而宋敏训等在2001年建立的aroA-PCR的敏感性更是进了一大步。他们利用aroA基因设计了1对引物.分别对10株标准副鸡嗜血杆菌(Hpg)菌株、14株分离的Hpg菌株进行PCR扩增.结果均得到了与预期大小一致的片段.而对10株非Hpg菌株和3株病毒进行扩增则无相应片段产生；该PCR能检到出10个菌细胞。 

细菌分离是检测病鸡病料中副鸡禽杆菌常用的方法，但副鸡禽杆菌的生长依赖NAD，对细菌的分离培养可按常规操作将病料接种于鲜血琼脂培养基(在金黄色葡萄球菌划线附近生长)，补充NAD的鸡肉汤培养基。细菌的分离培养对确诊是十分有必要的，但往往不能成功， 这是因为副鸡禽杆菌十分娇嫩，难以满足其生长需要。而PCR技术以其特异性强，所需病料组织少，敏感，方便等优点已得到世界公认，广泛应用于各种微生物、病原体等多种动物病原的临床检测和病原确诊。 

发明内容

本实用新型的目的是为克服细菌分离鉴定分离率成功率不高，无法确诊，检测成本高的不足之处，采用PCR技术，提供一种副鸡禽杆菌pyrG基因检测试剂盒。 

本实用新型试剂盒包括由盒本体，在本体内从上至下依次设置有第一海绵垫、隔离硬纸板、第二海绵垫，第一海绵垫上设有4个放试剂管的小孔，分别放置：10×PCR Buffer(含Mg2+)试剂管、dNTP试剂管、引物pyrG A试剂管、引物pyrG B试剂管，第二海绵垫上设有4个放试剂管的小孔，分别放置：TaqDNA聚合酶试剂管、Marker DL-2000试剂管、阴性对照试剂管、阳性对照试剂管，盒本体1底层放置说明书。 

检测用引物有两对：上游，pyrG A；下游：pyrG B。 

pyrG A上游5-GCGGGACACGATGTGGCTAT-3 

pyrG B下游5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3 

对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为阳性对照，阳性对照为副鸡禽杆菌Apg-8标准株(CVCC254)购自中国兽药监察所。 

本试剂盒保存于4℃，尽量减少反复冻融。 

本实用新型主要用于在病鸡眶下窦组织中检测细菌来对鸡群进行疫病诊断和病原确诊，从而指导临床病鸡群的临床用药和饲养管理，预防副鸡禽杆菌的发病和健康鸡死亡，减少养殖场和养殖户的损失。