[发明专利]用于检测和测定鹅去氧胆酸的抗体、方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及小分子半抗原的抗体及其制备方法与应用，特别是涉及鹅去氧胆酸及其衍生物的抗体及其制备方法与应用。

背景技术

本发明涉及用于检测和定量鹅去氧胆酸的方法和试剂盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶联物(conjugate)和抗体。

其中“检测”是指定性分析物质是否存在。

其中“测定”是指对物质进行定量分析。

鹅去氧胆酸是鸡胆汁的有效成分之一，其含量占鸡胆汁中胆汁酸的80％，其属于甾体化合物，为无色针状结晶，无臭、味苦。几乎不溶于水，易溶于乙醇、冰乙酸、微溶于氯仿。是目前世界上用量最大的治疗胆结石药物之一，又是合成熊去氧胆酸(UDCA)和其他的原料。口服吸收后部分与肝结合，部分经胆汁排出。

分子式：C24H40014分子量：392.56

药理作用

研究表明，鹅去氧胆酸显示多种生物学活性和药理作用。据报导鹅去氧胆酸能抑制肝细胞对胆固醇的合成，使胆汁中胆固醇与胆酸比例适度，具有较强的利胆的作用，因而在临床上主要用于治疗胆结石症，尤其对胆固醇型胆结石有很好的溶解作用，是目前世界上用量最大的治疗胆结石药物之一。而最近的研究显示在对小鼠灌胃后，还能够产生极其显著的镇咳、化痰、平喘作用。

鹅去氧胆酸化学结构如下：

目前建立了多种鹅去氧胆酸的定性与定量检测和测定分析方法，如薄层层析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色谱法。但含鹅去氧胆酸的生物样品(包括血浆、尿、唾液等)含有大量的影响含量测定的蛋白质及内源性物质；同时鹅去氧胆酸可能呈结合状态，必须经过处理，排除内源性杂质和代谢物的干扰，使结合状态的鹅去氧胆酸游离后才能测定；同时还需要浓缩以满足仪器检测灵敏度的要求，处理程序复杂，费时费力；另外由于鹅去氧胆酸进入体内后，组织中的分布是极其微量的，即使经过富集，进行含量测定仍是极其困难的。最后，对于鹅去氧胆酸在靶器官和组织中分布，以及细胞和亚细胞定位的研究，需要通过免疫组织化学和westblot等方法，但由于缺乏鹅去氧胆酸的抗体，阻碍了此方面的研究。因此，有必要开发出一种用于检侧和测定生物样品中鹅去氧胆酸的方法，对阐明相关药材或复方的作用机理，以及其体内分布和代谢研究，将具有特别的价值。

发明内容

本发明的半抗原鹅去氧胆酸可提供确定的结构性抗原决定部位，但是它本身并不具备免疫原性，因此必须要偶联到适宜的赋予抗原性的载体物质上，这样所形成的免疫原才会在注射到宿主动物体内后诱发免疫应答。因此，本发明提供一种如下结构的免疫原：

其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，优选R＝0，即P1直接与鹅去氧胆酸氧化后的醛基结合，或R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基，更优选R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚烷基。

P1是赋予抗原性的载体物质。载体物质选自蛋白质、蛋白质片合成的多肽或半合成的多肽。其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目镜蛋白和脂蛋白，优选为牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、血蓝蛋白(keyholelimpethaemocyanin，KLH)，更优选自锁眼形血蓝蛋白或牛血清蛋白(BSA)。合成多肽或半合成多肽是具有足够数量的可利用氨基的合成聚氨基酸，优选多聚赖氨酸。合成或天然聚合物是带有反应官能基的聚合物材料，特别是能够结合到半抗原产生免疫原的碳水化合物、酵母或多糖。

半抗原的制备本发明描述了半抗原鹅去氧胆酸的糖苷结构中的两个邻羟基经过过碘酸钠氧化为醛基从而与载体物质发生的偶联作用，产生免疫原。偶联物成功制备并纯化后分别经质谱(MS)和核磁共振氢谱和碳谱(1HNMR和13CNMR)确证。

免疫原的合成：本发明的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域己知的任何连接方式。例如过碘酸盐氧化法等。采用过碘酸氧化法制备免疫原时，是将10毫克的半抗原鹅去氧胆酸溶解在10ml热水中，加入含有8毫克的过碘酸钠溶液0.5毫升，室温下反应一个小时，离心，取上清液加入到10-20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-20℃的冰箱中。