[发明专利]新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株反向遗传操作系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及病毒遗传操作领域，更具体地，本发明涉及一种新城疫病毒 Mukteswar中等毒力疫苗株反向遗传操作系统及其应用。

背景技术

Angela Romer-Oberdo rfer等与BEN P.H.PEETERS等于1999年分别首次发表文 章《Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA》 (Journal of General Virology(1999),80,2987–2995)和《Rescue of Newcastle Disease  Virus from Cloned cDNA:Evidence that Cleavability of the Fusion Protein Is a Major  Determinant for Virulence》(JOURNAL OF VIROLOGY,June1999,p.5001–5009)， 公开了一种利用T7启动子控制转录系统，来拯救新城疫病毒弱毒株，之后又有一些 人陆续拯救了不同毒株的新城疫病毒，所有这些新城疫病毒的拯救系统均是受控于 T7启动子，该类新城疫病毒反向遗传操作系统均是利用表达T7RNA聚合酶的特殊 细胞系，并需要表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒额外提供T7RNA聚合酶来有效拯 救重组新城疫病毒。在这一类系统中，新城疫病毒的全基因组cDNA克隆于T7启动 子之下，其拯救病毒所需的必需蛋白NP、P和L的基因也多构建于受T7启动子控制 的质粒上。在拯救病毒的过程中，首先需要用表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒感染 可以表达T7RNA聚合酶的细胞系(如BHK-T7)，之后再将辅助质粒与全基因组质 粒共转染该细胞系，依靠细胞内生成的T7RNA聚合酶来转录出新城疫病毒的基因组 RNA，并与辅助质粒表达的NP、P和L装配成核衣壳，最后以出芽方式生成重组新 城疫病毒。该种反向遗传操作系统存在的问题是需要制备稳定表达T7RNA聚合酶的 细胞系，制备细胞系的过程复杂，技术要求高，周期长，并且细胞系的培养过程中 需要不断添加维持压力的抗生素以保持其稳定表达T7RNA聚合酶，但是随着细胞传 代次数的增加，其表达T7RNA聚合酶的能力会不断降低，直至消失；另外在转染过 程中感染的表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒会一直存在于细胞中，不但在拯救重组 新城疫病毒过程中需要添加阿拉伯糖苷以抑制此痘病毒的复制，而且在拯救出重组 病毒后还需要通过过滤或多次稀释传代的方式去除痘病毒，这不仅会降低新城疫病 毒的拯救效率，还存在有痘病毒污染的风险，在这种方法的研究中，如果不过滤转 染的细胞培养物，新城疫病毒的拯救效率较高，但是去除痘病毒很复杂，如果过滤 转染的细胞培养物，则新城疫病毒的拯救效率很低，甚至失败。

为了更有效利用新城疫病毒这一良好载体，针对以上所述现有技术中的缺点， 我们建立的新城疫病毒中等毒力Mukteswar疫苗株反向遗传操作系统完全抛弃了 原来使用的T7启动子控制下的T7RNA聚合酶系统，而是利用所有培养细胞系具 有的真核细胞启动子，而且辅助质粒的表达也是受控于真核启动子，这一系统可以 在多种细胞系上完成拯救病毒的过程，效率不受影响(如Vero、BHK21、DFEI等 细胞系)，我们的拯救系统使用的细胞系是广泛用于疫苗生产的Vero细胞，这对于 今后开发本毒株为载体的疫苗奠定了安全基础。目前国内研究者已经拯救出新城疫 LaSota弱毒疫苗株(葛金英等，Newcastle Disease Virus-Based Live Attenuated  Vaccine Completely Protects Chickens and Mice from Lethal Challenge of Homologous  and Heterologous H5N1Avian Influenza Viruses)以及新城疫病毒强毒株，这些反向 遗传操作系统也均是建立在T7启动子控制下的，但是弱毒株由于毒力低下，利用 效果有限，而强毒株存在生物安全问题。目前还没有别人拯救出新城疫病毒 Mukteswar株，这株病毒是新城疫病毒中等毒力株，该毒株反向遗传操作系统的建 立，将为研究新城疫病毒低毒力株与高毒力株之间的遗传演变提供有力工具，也为 开发以此毒株为载体的疫苗奠定了基础。