[发明专利]一种补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌性疫苗免疫动物或者健康人群后，产生的血清抗体具有功能性杀菌或抑菌活性评价技术领域。

技术背景

血清抗体杀菌力检测，可以衡量一个特定物种的免疫球蛋白的功能特性。血清抗体杀菌力检测依赖抗体识别条件，通过经典途径激活，使表面暴露的抗原与补体、抗体结合，导致抑菌或溶菌。现有的血清抗体杀菌力检测，其步骤及结果判定方法复杂，特别是需要人的肉眼直接进行活菌计数，误差较大，试验耗时长，且适用范围有限。以下以流脑血清抗体杀菌力试验为例说明其现有血清抗体杀菌力检测方法具体操作：

1、菌悬液制备

启开菌种，于固体培养基上复苏培养后，接种于液体培养基中扩增培养。菌液稀释制成均匀的菌悬液。取菌悬液于波长为540nm的分光光度计上测其光密度值，再稀释至所需的最终浓度(例如：4000个菌落形成单位/毫升)。

2、杀菌抗体检测

2.1待检血清稀释

先在微孔板每孔内加25μl稀释液。用移液器从每排第一孔内加25μl经56℃、30min灭活的待检血清，吹吸5～10次后吸出25μl至下一孔，如此作连续倍比稀释至最后一孔。

2.2杀菌反应

每孔中加入12.5μl补体，再加入稀释好的菌悬液12.5μl，振荡器上中速振荡5分钟后，于37℃培养25分钟，再振荡5分钟。

2.3杀菌后显色培养

每孔加50μl已熔化冷至45℃左右的TTC琼脂后，微孔板置37℃条件培养15～20小时后观察结果。

3、结果判定

3.1对照设置

阳性参考血清对照；4孔补体对照(稀释液、补体、菌液各一滴，检查补体自然杀菌活性)；4孔细菌生长对照(稀释液、灭活补体和靶菌菌液各12.5μl)。每次检测时至少每5块微孔板中应有一组上述三种对照试验。

3.2活菌计数判定结果

3.2.1菌悬液空白对照检验

各孔滴完菌悬液之后，将该菌悬液两滴分别滴加到一个琼脂平皿的一端，沿着划好的两条线倾斜下流，于37℃与微孔板同时培养，次日检查每滴菌悬液的菌落数及其纯度。

3.2.2检查三种对照设置的结果：

补体的和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落；阳性参考血清应达到原来确定的杀菌滴度。若所试各孔中红色点状菌落数目明显地少于补体对照孔或不出现红色点状菌落时，则判断为杀菌阳性；如果所试孔中的菌落数目接近补体对照孔的一半或更多时，则判断为杀菌阴性。

3.2.3杀菌结果判定标准

通过人的肉眼观察并一个一个逐一地计算菌落个数(活菌计数)，根据红色点状菌落数目的多少，以符号“+”记录试验结果。若补体及靶菌生长对照各孔的细菌正常生长时，应出现众多红色点状菌落，可记为“++++”。当所试各孔与其比较，菌落数减少30％以下，记为“+++”；减少50％左右记为“++”；减少70％左右记为“+”；每孔少于10个菌落则记为“±”。以细菌生长成呈“+”及以下者判断为杀菌阳性；以“++”及以上者判为杀菌阴性。以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴度。

因此，现有血清抗体杀菌力检测结果判定需通过肉眼观察计数菌落的活菌计数的方式，获得待检血清组及生长对照组的活菌数并进行比较，若待检血清组活菌数相对于生长对照组减少70％则判为阳性。由于微孔板上视野差，肉眼观察计数菌落错误率高，经常出现漏计或重复计数的情况，结果误差较大，工作量大、繁琐复杂。若菌悬液浓度过高，菌落在微小的孔内密集生长呈片状菌苔，观察不到单一的菌落，导致无法对杀菌检测结果予以判定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有血清抗体杀菌力检测方法存在需通过肉眼观察计数菌落，经常出现漏计或重复计数的情况，计数错误率高，结果误差较大，工作量大、繁琐复杂的缺陷。其目的是开发一种步骤简单，结果直观易于分辨，判定方法可靠的补体介导的血清抗体依赖性杀菌活性的检测方法(Complement-Mediated Antibody-Dependent Bactericidal Activity Test，CMAB)。

本发明的方法是用抗原(疫苗或菌体)免疫试验动物(包括品系小鼠、家兔、恒河猴)或健康人群，获得免疫后的特异性血清，再将特异性血清抗体、补体(与免疫动物非同源)和检测菌按顺序混合后反应，选择合适的活菌显色剂区分具有活性的菌体和死菌，使得实验者可快速直观的对试验结果进行判定。

本发明所提供的技术方案如下：