[发明专利]尤韦可拟盘多毛孢代谢产物在防治猕猴桃褐腐病菌中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株来源于药用植物牡蒿的拟盘多毛孢属内生真菌尤韦可拟盘多毛孢(Pestalotiopsis uvicola)GMH31代谢产物在农业中的应用。 

背景技术

植物内生真菌(fungal endophyte)是指生活史的一定阶段或全部阶段生活与健康植物各组织合格器官内的真菌。它们与宿主植物通过互作形成了紧密的共生关系，可以促进植物的生长，提供植物应对胁迫的适应能力，有的植物内生真菌还具有药用价值。从植物内生真菌中寻找和发现活性化合物已成为国内外研究的又一热点。如中国专利文献CN201310194836.5公开了一株龙胆中分离得到的内生真菌(Metarrhizium)LD421，可用于防治龙胆叶枯病；专利申请CN201210067829.4则公开了从银杏根、茎、叶等组织中分离得到的内生真菌腐皮镰孢菌T-7，对辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、苹果腐烂病菌等具有很好的抑制作用。 

牡蒿(Artemisia japonica)为菊科蒿属植物，其味苦、微甘、性凉。民间又称土紫胡(《陆川草本》)、胃痛灵、熊掌草，以全草入药。具有清热、凉血、解毒、健胃止血功效，主要用于治疗感冒发热，中暑、疟疾、肺结核潮热、高血压病、五痨七伤、大小便不通和毒蛇咬伤等。同时也有记载牡蒿为药食两用植物，含有多种活性物质，具有免疫、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂保肝以及延缓衰老等多种生理功能。另外，牡蒿还可用于制备生物农药，作为杀虫剂使用。 

目前在农业生产过程中控制农作物病虫草害的主要手段是化学农药防治，其对减轻病虫草害，保证农作物丰产丰收起到积极的作用，但是由于自然界生物之间的相互制约相互依存，现在已不建议过分依赖化学农药在进行病害的处理。因此，对植物内生真菌的研究，利用植物内生真菌与宿主植物生物活性共生的关系，来筛选具有高生物活性的内生真菌，进一步获得活性产物，是今年来研究的一大 热点。但是，对于某一宿主植物，究竟何种内生真菌或哪几类内生真菌具有抗病原微生物活性，且各内生真菌中哪种菌活性最高，分离纯化是否容易，发酵过程是否复杂等等，都是需要进行大量研究加以证实的，目前尚未发现牡蒿内生真菌及其分离培养和抗病原微生物活性、药用活性应用的具体报道。 

发明内容

本发明的目的是针对化学药品不安全与微生物源药品种类较少的不足，提供一种从药用植物牡蒿中分离筛选出的内生真菌——尤韦可拟盘多毛孢(Pestalotiopsis uvicola)。 

本发明所述内生真菌，是从贵州省贵阳市郊区的药用植物牡蒿(Artemisia japonica)中分离获得的，命名为内生尤韦可拟盘多毛孢(Pestalotiopsis uvicola)GMH31，并对该菌株的发酵代谢产物进行了多种生物活性研究。该发明为微生物源农药和医药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株。 

本发明技术方案如下： 

本发明尤韦可拟盘多毛孢的分离、筛选与鉴定： 

是于2011年8月在贵州省贵阳市郊区采集的牡蒿叶片中，经分离、纯化、培养、发酵和活性测定等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为尤韦可拟盘多毛孢(Pestalotiopsis uvicola)，定名为尤韦可拟盘多毛孢(Pestalotiopsis uvicola)GMH31。该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期2014年6月30日，保藏登记号CCTCC NO:M2014303，地址湖北省武汉市武昌珞珈山。 

具体的分离培养方法为： 

(1)牡蒿植物组织的准备：采集牡蒿的叶组织，用自来水冲洗，除去样品表面的表生微生物，然后放于干净的纱布上风吹晾干； 

(2)表明消毒及无菌检测：晾干后的组织块剪成适宜大小，用灭菌蒸馏水冲洗干净，叶片消毒采用75％乙醇浸泡1-2min、0.1％HgCl₂溶液浸泡3-4min，然后用灭菌蒸馏水冲洗至消毒液无残留，用灭菌滤纸吸干组织段表面残留水滴后，切成直径4～6mm大小的组织切段； 

(3)内生真菌的分离纯化：将步骤(2)消毒后的组织切段接种于含有硫酸链霉素(100μg·mL^-1)和青霉素(50μg·mL^-1)的PDA培养基平板上，封口后于25-30℃恒温培养2～7天，至菌丝体从组织块中长出，采用尖端菌丝挑取法，将菌丝转移至 纯化PDA培养基平板上，于25-30℃下进行纯化培养5～9天，长出完整菌落，即为牡蒿内生真菌。