[发明专利]一种基因重组玫烟色棒孢霉菌If01 GM及其应用

权利要求书

1.一种基因重组玫烟色棒孢霉菌If01 GM（Isariafumosorosea If01 GM），其特征在于，该菌株于2014年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014199，保藏地址为中国武汉武汉大学。

2. 根据权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌If01 GM，其特征在于，该菌株携带有B型烟粉虱TOLL受体基因TLR7的正反向核苷酸片段，所述TLR7的正反向核苷酸片段序列如SEQ ID NO：1所示；该菌株能够沉默烟粉虱免疫相关基因，即TOLL受体蛋白基因TLR7。

3. 根据权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌If01 GM，其特征在于，该菌株的形态学特征为：

在察氏培养基上：起初菌落规则圆形，隆起，菌丝白色，背面淡黄色或黄褐色；延长培养，菌落呈不规则圆形，形成肉红色孢子层；

显微镜下观察：菌丝体细长，无色透明，宽度2.70~3.8 μm，产大量分生孢子，孢子无色透明，柱状至椭圆形，长4.9~6.4 μm，宽1. 9~2.4 μm。

4. 一种权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌If01 GM的构建方法，其特征在于，步骤如下：

S1.构建重组质粒

S11.提取B型烟粉虱的总RNA，合成第一链cDNA；

S12.以S11的cDNA为模板，利用引物TLR7F和TLR7R，进行PCR扩增，得目的片段；

S13.以S12目的片段为模板，分别利用引物TLR7F-1和TLR7R-1，引物TLR7F-2和TLR7R-2，进行PCR扩增，得到正向片段和反向片段；

S14.将正向片段XhoI、HindII双酶切，经回收、纯化后，连接到XhoI、HindII双酶切过的pSilent-1质粒，得P-Z质粒；

S15.将反向片段KpnI、SphI双酶切，经回收、纯化后，连接到KpnI、SphI双酶切过的P-Z质粒，得重组P-Z-F质粒；

S2.构建重组菌株

S21.获得玫烟色棒孢霉IfB01菌株的原生质体；

S22.重组P-Z-F质粒转化原生质体，得转化子；

S23.转化子经过阳性筛选和毒力测试，得到基因重组玫烟色棒孢霉菌 If01 GM；

其中，S12所述目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

S12所述引物TLR7F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，TLR7R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

S13所述引物TLR7F-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，TLR7R-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

S13所述引物TLR7F-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，TLR7R-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

5. 根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，S12或S13所述PCR扩增的扩增程序为：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃补平10 min。

6. 权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌If01 GM应用于防治烟粉虱。

7. 权利要求1所述基因重组玫烟色棒孢霉菌If01 GM应用于制备防治烟粉虱的药剂。

8. 根据权利要求6或7所述应用，其特征在于，所述烟粉虱为B型烟粉虱。