[发明专利]TaHMA2基因启动子和第一内含子调控基因表达的功能

说明书

技术领域

本发明属于植物启动子和内含子领域，是关于一个具有组织特异性表达的启动子序列和一个具有启动子活性并有组织表达特异性的内含子序列，以及这两个序列在植物转基因领域的用途。 

背景技术

锌(Zn)是生物有机体所必需的微量元素之一，在众多的生理过程中起重要作用。近年来的研究表明，植物以及人体中的Zn缺乏现象是很多国家面临的重大问题(Alloway，2004；Hotz and Brown，2004)，提高作物可食部位的Zn含量是解决人类Zn影响缺乏的重要途径(Cakmak，2008)，因此明确Zn在植物体内转运、分配的分子机理有着重大的现实意义。本专利涉及到的小麦TaHMA2蛋白就是一个具有跨质膜转运Zn、Cd的P_1B-type ATPase，其基因是从高Zn小麦品种京冬8号中克隆得到的，含有8个内含子，其中第一内含子为889bp(Tan et al.，2013)。研究TaHMA2基因的转录调控序列是分析其蛋白Zn转运功能的重要组成部分，这在通过植物基因工程来调控作物可食部位的Zn营养或降低Cd毒害方面具有重大意义。 

影响基因表达的因素表现在多个水平，如DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后加工等。启动子是指可被RNA聚合酶及一些反式作用因子特异识别并与之结合，从而正确有效起始基因转录的一段特异DNA序列，它对基因的表达具有决定性的调控作用。启动子一般包含两个组成部分，一是核心启动区，是形成普遍转录结构所需要的，包括转录起始位点和邻近的TATA框等；二是决定基因转录特异性和活性的区域，一般包含多个保守域，其种类、拷贝数及在启动子的位置在不同启动子间存在较大差异。一般认为，启动子可分为组成型、诱导型和组织特异型三大类。某些情况下，一种类型的启动子往往兼具其他类型启动子的特征。组成型启动子启动基因的表达不受时空和环境条件限制；诱导型启动子启动基因的表达受特殊环境信号(物理的、化学的或生物因素等)的诱导调控；组织特异性启动子可调控基因在特定器官、组织或细胞中表达。 

真核生物基因经常含有一个或多个内含子，在mRNA成熟的过程中这些内含子最终都会被精确地剪切除去，这是真核生物基因表达的基本特征之一。约80％以上的植物基因具有内含子，其5’和3’剪接位点的共有序列分别为CAG：GUAAGU和GCAG：G(“：”为剪切部位；下划线表示高度保守的位点)(Lorkovic et  al.，2000)。前人研究表明，内含子及其从转录前体中被剪接复合体除去的过程影响mRNA代谢的整个过程，包括转录起始、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、翻译和降解等(Le Hir et al.，2003)。研究发现有的内含子对基因表达具有增强作用，植物中最早的相关报道是玉米Adh1基因的第一内含子(Callis  et al.，1987)，此后又发现了许多具有增强基因表达的其他植物基因内含子，例如水稻Act1基因(McElroy et al.，1990)、拟南芥UBQ3,10,11基因(Norris et al.，1993)和马铃薯Sus3基因(Fu et al.，1995b)等的内含子。研究认为内含子的转录增强作用与其在转录单位内的位置和取向有关，一般情况下，内含子正向插入转录单位5’端是增强基因表达所必需的(Clancy et al.，1994；Mascarenhas et al.，1990)，但也有与增强子类似的内含子，即其增强基因表达的功能与其在转录单位内的位置和方向无关(Gidekel et al.，1996；谢先芝and吴乃虎，2001)。一般认为，具有增强基因表达的内含子可通过增强转录效率、稳定mRNA等方式来增强mRNA的积累，从而增强基因的表达水平(Clancy and Hannah，2002；Rose and Beliakoff，2000)，此外单子叶植物基因内含子增强基因表达的能力往往高于双子叶植物。有研究表明，有些植物基因的内含子可以影响基因的表达模式，例如马铃薯sus3(Fu et al.，1995b)和sus4(Fu et al.，1995a)基因的内含子均可影响其基因的表达水平和组织表达模式。研究还发现，有的基因内含子具有启动子活性，动物中相关的报道较多，而高等植物中则非常少，其中玉米Ubiquitin基因的第一内含子(包括其较小的第一外显子)(Salgueiro et al.，2000)和水稻Ostub16β-tubulin基因的第一内含子(Morello et al.，2002)均具有启动子活性，且均含有TATA box和/或CAAT box。综 上所述，有些植物基因的内含子在基因表达过程中可能具有重要的启动和调控作用，值得深入分析。