[发明专利]一种利用矿物油覆盖延长葡萄组培苗保存时间的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用组织培养技术进行葡萄种质资源离体保存的方法。

背景技术

由于人口增长、工业污染、环境恶化等原因，一些稀有物种面临灭绝或濒于绝种，加上人工选择及良种的推广，种植品种单一化，许多有益的珍贵种质资源丢失，植物种质资源保存已成为全球性关注的课题。

离体保存种质资源是将植物外植体在无菌环境下进行组织培养保存，具有很高的繁殖系数，需要时能将保存材料大量繁殖；可克服田间保存法的缺点，不占用土地，免去田间管理；免受自然灾害侵袭及病虫、病毒危害；易于控制及便于种质交流；已成为植物种质资源保存的重要方法，受到国际植物界的高度重视。

在组织培养保存种质的过程中，由于培养基水分蒸发，营养消耗，每隔一段时间，要将培养物及时转移接种到新培养基中，进行继代培养。葡萄组培苗一般2个月继代一次，最长可保存4个月左右，频繁继代要消耗大量的人力、物力和时间，随继代次数的增加，还会导致体细胞无性系变异几率增加，有可能使保存的原始种质丢失。通过改变培养物生长条件，调控组培苗的生长节奏，延缓其生长，可以有效减少继代次数，改良种质资源离体保存方法。

延缓组培苗生长的主要途径有：在培养基中添加生长延缓剂；提高培养基渗透压；降低培养温度，改变光照强度；降低培养环境的氧气含量等。苹果等木本植物组培苗放入冷藏箱，降低培养温度后延缓生长的效果很好，但葡萄抗寒性较差，大部分品种不能长期适应10℃以下冷藏箱的条件。通过在培养基中添加PP333等生长延缓剂或加入甘露醇提高培养基渗透压可有效抑制葡萄组培苗生长，但由于室温下培养，封口材料透气，培养基水分蒸发殆尽，葡萄组培苗只能延长约3个月的保存时间。本发明利用矿物油覆盖葡萄组培苗，有效抑制了培养基水分蒸发，通过降低培养环境的氧气含量，延缓了组培苗生长，延长了保存时间。

发明内容

本发明建立了一种延长葡萄组培苗保存时间的方法，为有效利用组织培养技术进行葡萄种质资源的离体保存提供技术支撑。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：将葡萄组培苗嫩梢去掉叶片，切分成单芽茎段接种，在培养基表面倒入无菌矿物油覆盖组培苗，常规培养条件培养，可有效延长葡萄组培苗的保存时间。

本发明的具体内容，即延长葡萄组培苗保存时间的具体方法步骤如下：

（1）制备葡萄继代培养基：B5+IAA0.5mg/L+蔗糖25.0g/L+琼脂6.0g/L，培养基灭菌前调节pH6.0；培养容器采用50ml或100ml三角瓶，若考虑节省矿物油，可选用50ml三角瓶。

（2）将葡萄组培苗嫩梢去掉叶片，切分成1.5cm左右的单芽茎段，接入培养基中；在培养基表面倒入无菌矿物油，矿物油液面高出培养基表面5-6cm，50ml三角瓶约需40ml，100ml三角瓶约需80ml，用封口膜封口。

（3）常规培养条件：温度25±3℃，光照强度2000lx左右，光照时间10-14h/d。

（4）覆盖矿物油的葡萄组培苗一般可保存15个月以上。

（5）去掉矿物油后，无需冲洗，保存的组培苗即可恢复生长。

本发明专利的有益效果是，通过矿物油覆盖，显著减少了培养基水分蒸发，降低了培养环境的氧气含量，有效延缓了葡萄组培苗生长和营养消耗，成功将葡萄组培苗的保存时间由4个月延长至15个月以上，大大减少了继代接种的工作量，也降低了变异几率。该技术可应用于巨玫瑰、莫丽莎、巨峰、夏黑、粒粒特、皇家夏天、皇家秋天、克瑞森、赤霞珠、红斯威特等葡萄品种组培苗，具有适应品种广、保存时间长、成本低（矿物油可重复利用）、操作简便、易恢复生长等优点，是目前葡萄种质离体保存的好方法。

附图说明

图1接种后覆盖矿物油的葡萄组培苗。

图2保存了15个月的葡萄组培苗。

 

具体实施方式

通过矿物油覆盖，减少了培养基水分蒸发，降低了培养环境的氧气含量，有效延缓了葡萄组培苗生长，成功延长了葡萄组培苗的保存时间。经试验验证，具体实施过程要注意以下问题：（1）葡萄组培苗接种时最好去掉嫩梢叶片，只留约1.5cm长的单芽茎段，腋芽在矿物油中萌发缓慢，节间缩短，叶片明显减小，生根晚，根细且短小，无侧根，延缓生长效果好。（2）接种后要立即覆盖无菌矿物油，如果接种后先培养一段时间，待腋芽萌发生长后再覆盖矿物油，容易造成组培苗很快枯尖、死亡，保存时间短。（3）覆盖矿物油最好一次加够量，如果只高出培养基表面2-3cm，组培苗5-6个月后即长出矿物油液面，开始恢复生长，继续存活3-4个月即干枯死亡。因此矿物油应尽量多加，一般高出培养基表面5-6cm，将到三角瓶瓶颈即可，50ml三角瓶约需40ml，100ml三角瓶约需80ml，用封口膜封口。如果开始矿物油加量不够，待组培苗快长出液面时可以添加，只是既麻烦、又增加带菌污染的几率。在常规培养条件下，矿物油覆盖法已成功保存了巨玫瑰、莫丽莎、巨峰、夏黑、粒粒特、皇家夏天、皇家秋天、克瑞森、赤霞珠、红斯威特等十几个葡萄组培种质及部分花卉组培苗达15个月以上。