[发明专利]一种制备抗Lp（a）多克隆抗血清的引物、质粒及应用

说明书

技术领域

本申请涉及抗血清制备领域，特别是涉及一种用于制备抗Lp（a）多克隆抗血清的引物、质粒，以及该引物和质粒的应用。

背景技术

血浆脂蛋白按密度分为四大类：乳糜微粒(缩写，CM)、极低密度脂蛋白(缩写，VLDL)、低密度脂蛋白(缩写，LDL)和高密度脂蛋白(缩写，HDL)。同时，在血浆中还存在一类特殊的脂蛋白：脂蛋白(a)（缩写，Lp(a)），它是一个独立的脂蛋白系统。Lp(a)的脂质成分与LDL相似，主要由胆固醇脂和甘油三酯组成，表面被覆一层磷脂和游离胆固醇，甘油三酯的组份大于LDL，Lp(a)与LDL均是胆固醇转移蛋白的底物。Lp(a)含有两类载脂蛋白：ApoB100和Apo(a)，前者与LDL的ApoB100相同，ApoB100上有LDL受体结合位点；后者是Lp(a)的独特载脂蛋白，ApoB100和Apo(a)通过1至2个二硫键共价相连。

从Apo(a)的N-末端到C-末端，所有的Kringle域通过两两之间的大约30个氨基酸的中间序列依次相连。除最靠近C端的Kringle域与纤溶酶原中的Kringle5同源外，其余Kringle域均与纤溶酶原中的Kringle4同源，并依次被命名为KringleⅣ1～10型；需要说明的是，人类Apo(a)与人纤维蛋白溶酶原(英文名，Plasminogen.缩写，PLG)在DNA和蛋白质水平均存在80%的同源性，从而具有共同的抗原决定簇，呈免疫交叉反应。在所有这10型的KringleⅣ中，不同个体的KringleⅣ2型的串联重复数一般在3～43之间变化，因此Apo(a)的分子量也就在250～838kD的范围中变化，其体积与分子量在相同的个体内或不同的个体间都具有较大的差异，因其这种特性，决定了Lp(a)在不同的个体间具有较大的差异。KringleⅣ9型中有7个半胱氨酸，其中未参与分子内二硫键的第4057位半胱氨酸(缩写，Cys4057)与载脂蛋白B-100中的第4326位半胱氨酸(缩写，Cys4326)形成分子间二硫键，进而组成完整的Lp(a)。

Lp(a)是动脉粥样硬化的独立危险因素，是冠心病(CHD)、心肌梗塞(MI)、脑卒中、动脉重新狭窄的危险因子。另外，Lp(a)水平可作为慢性肾功能衰竭合并心脑血管病及血栓形成的预示指标。Lp(a)的血清水平受遗传因素的高度影响，个体差异很大，主要由Apo(a)基因决定，因种族而异，与性别、年龄无关，不易受环境，生活方式和一般降脂药物的干扰，仅能够被肾衰、急性免疫反应轻微影响。一般把人血清Lp(a)正常值定为<300mg/L。因此，Lp(a)的检测对临床分析和病理分析具有重要的参考价值。

目前，已知的检测Lp(a)浓度的方法有酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫测定法和免疫比浊法，以上免疫检测方法均需要特异性强的Lp(a)抗血清/抗体作为核心原料。目前基本上都是采用提纯人血清的方法制备免疫原Lp(a)或Apo(a)，即利用超高速离心机通过密度梯度离心制取Lp(a)，或者利用SDS-PAGE电泳分离获得Apo(a)抗原；再利用抗原免疫动物获得抗血清。如前面分析，因为Lp(a)含有两类载脂蛋白：ApoB100和Apo(a)，其中ApoB100与LDL的ApoB100相同，所以利用Lp(a)作为免疫原制备的抗血清会与LDL存在免疫交叉反应。而利用Apo(a)作为免疫原，因Apo(a)的氨基酸结构与PLG很相似，而PLG是一种以较高浓度存在于人血液中的蛋白质，因此，利用Apo(a)作为免疫原制得的抗血清会因与PLG发生交叉反应。因此，无论是Lp(a)还是Apo(a)作为抗原制备的抗血清都无法准确地测定Lp(a)含量。并且，采用提纯人血清的方法制备免疫原Lp(a)或Apo(a)所需血浆来源困难、社会供给不足；制备的抗血清不仅会与LDL或PLG有交叉反应，特异性较差；而且，抗血清的效价也不高。

发明内容

本申请的目的是提供一种全新的制备抗Lp(a)多克隆抗血清的引物，基于该引物的制备抗Lp(a)多克隆抗血清的质粒，以及该引物和质粒的应用。

为了实现以上目的，本申请的一方面公开了一种用于制备抗Lp（a）多克隆抗血清的引物，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物含有Seq ID No.1所示序列，下游引物含有所示序列；

Seq ID No.1：5’-GACATATGAGAAAAGCCCTGTGGTCC-3’

Seq ID No.2：5’-GACTCGAGCCCACAATCAAATGAAGA-3’。