[发明专利]普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子作为基因载体的新应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子作为基因载体的新应用。

技术背景

转基因技术是一种非常重要的分子生物学手段，而用纳米粒子来制备基因转导的载体具有很多的优势。一个良好的基因转导载体需具备以下条件：其生物安全性好，在体内可实现生物降解，毒性和免疫原性较小；基因载体的大小合适，可以高效顺利进入细胞体内传递外源基因；可以高效的结合带有负电的核酸分子，具有很好的包封效果；载体在生理条件下比较稳定，不易发生聚集而形成沉淀；转染效果较好，可以有效的实现多种细胞的稳定的基因转染。

壳聚糖是一种广泛使用的药物载体和基因载体材料，具有生物相容性好，在体内可以进行充分代谢等特点，已经广泛应用于科研和临床实践当中，是一种非常理想的基因转染材料。

普鲁士蓝是临床上应用已久的解毒药物，其生物安全性好，在体内的毒性和副作用非常低，是一种很好的药物载体。最近研究发现普鲁士蓝是一种很好的光热材料，在用808nm激光器进行照射时可以产生热量来杀死肿瘤细胞。

采用808nm激光器照射普鲁士蓝等光热材料可以产生较高的温度，但是当控制照射时间和功率时，可以将光热产生的温度控制在一定范围之内，在保证细胞较高的存活率的情况下，通过升温促进细胞表面细胞膜的通透性，从而增强本载体的转基因效果。

本发明具有很多的优势和很好的应用前景：首先，普鲁士蓝和壳聚糖都是临床上正在应用的生物材料，其生物安全性得到了很好的保证；其次，普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子具有很小的粒径和较高的正电位，可高效吸附核酸，具有很好的包封效果；再次，在转基因操作时，采用808nm波长的激光器进行定点照射，可以有效的控制照射区域的温度，从而达到在靶向区域和特定部位增强转基因效果的功能；最后，该复合纳米粒子的制备方法条件温和，操作简单，所需原料安全易得，价格低廉。

发明内容

本发明的目的之一是普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子作为基因载体的新应用。

本发明的目的之二是提供上述普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子在细胞实验中通过光热作用增强转染效率的使用方法，特别是用于报告基因GFP基因对于动物细胞的转染方法。

为达到以上目的，本发明的技术方案为：

普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子的制备方法是以壳聚糖为骨架，在其上原位生长普鲁士蓝晶体，经过洗涤离心即得普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子。具体过程如下：

(1)将壳聚糖溶于稀盐酸中搅拌，通过0.22μm微孔滤膜的过滤灭菌器进行过滤后，加入铁氰化钾和氯化亚铁，搅拌后加入三倍体积的丙酮，10000g离心30分钟后用丙酮清洗干燥得到复合纳米粒子。其中所述的壳聚糖的分子量范围为2-30万，在0.5mol／L的稀盐酸中完全溶解，浓度为0.75mg／ml；所述的DNA溶液浓度为1mg／m；所述的普鲁士蓝的制备方法为向80ml的壳聚糖溶液中先后加入20ml，1mM的铁氰化钾溶液和20ml，1mM的氯化亚铁溶液，充分搅拌后颜色逐渐变为深蓝色，证明有普鲁士蓝晶体形成。

(2)上述制备得到的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子可以应用于基因转染。具体过程如下：

将普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子在水中溶解超声，将其与核酸在培养基中按照一定比例混合，使核酸在其表面吸附，将载体-DNA溶液入培养的HeLa细胞中，孵育1小时后用808nm激光器对其照射，使其通过光热作用更好的进入细胞，然后换回新鲜培养基继续培养48小时，在荧光显微镜下观察该载体的基因转染效果。

同现有基因载体相比较，本发明所述的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子开发为新型的基因转染载体，具有以下突出优势：

1本发明首次制备用普鲁士蓝和壳聚糖这两种生物安全性非常好的生物材料制备了普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子，并将其应用于基因转染，该方法操作简便，原料易得，价格低廉。

2本发明首次用808nm激光器对普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子进行照射，通过光热作用增强细胞膜的通透性促进了转基因效果。方法简单实用，可实现对特定区域的细胞增强转染效率，具有很好的操作性。

3与其他基因粒子相比，普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子具有生物安全性好，粒径较小易于摄取，价格较低，可以通过光照来控制局部的转染效率，转染效率高等特点。

附图说明