[发明专利]人工诱导的MLE转座子试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体而言，涉及一种人工诱导的Mariner-Like Element(MLE)转座子试剂盒及其在植物基因突变中的应用。

背景技术

随着新技术新方法的不断发展，分析鉴定基因功能的方法越来越多，大规模研究基因功能主要依赖于构建突变体库，但最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变群体，通过突变体分析鉴定基因功能。因此突变群体的构建是功能基因组学的基础。随着农杆菌介导的植物转基因技术的不断完善，通过创造大量的T-DNA独立转化子来建立T-DNA突变体库的方法已成为快速构建插入突变体库的主要方法。T-DNA插入突变具有插入稳定、操作简单，但是易产生直接的串联，反向重复和在边界产生缺失，影响随后的分子分析。

转座子是指在基因组上能从同一条染色体的一个位置转移到另一个位置或者从一条染色体转移到另一条染色体上的一段DNA序列，具有分布广泛、拷贝数高、插入位点专一、产生突变稳定、不受植物种类差异的影响、异源转座率高、组织培养诱导激活等优势。可以在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签(transposontagging)。其原理是利用植物转座子的插入造成基因突变，以转座子序列为基础，从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆，它必定含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列从野生型基因组中获得完整的基因。

以转座子作标签分离基因有以下优点：（1）转座子插入引起的突变会由于转座子的切离而回复。（2）由于转座子总是沿其邻近的位点转座，因此只要转座子在染色体上定位后，就很容易确定与其连锁的突变基因的相对位置。（3）由于转座子的不断跳跃，一旦把转座子导入目标植物，通过自交、杂交、回交等手段便可得到一个较大的含不同插入位点的转座子群体。（4）把转座子导入异源植物不受转化条件的限制。目前利用转座子标签法成功克隆植物基因目前仅限于Ac/Ds和Spm/dSpm这两类转座子，这两类转座子均存在着转座活性不高，突变效率不理想和优先转座到与之相临近位置的问题，是目前利用转座子构建随机饱和突变体群的主要障碍。因此进一步研究、挖掘新的转座子，改进试剂盒，达到最佳标签条件，是当前转座子标签法研究的主要任务。

Mariner-Like转座子(Mariner-LikeElements,MLE)是DNA转座元件中一个重要家族，最早是在研究毛里塔尼亚果蝇(Drosophilamauristiana)白眼基因的一个不稳定突变时发现的。此后在其他动物以及植物基因组中也发现了大量MLE转座子的存在。MLE转座子通过DNA的切除/粘贴机制来实现转座。与其它转座子相比较，MLE转座子有以下三个显著特点：（1）结构简单，由两端反向重复序列(TerminalInvertedRepeats,TIRs)和编码转座酶的基因组成，反向重复序列长度一般为10-40bp。转座酶编码序列长度一般为1000-1500bp，由DNA结合域和转座催化域组成。既能催化短至200bp，仅包括TIRs及侧翼序列的DNA片段转座，也能催化携带有目的基因（如抗性基因），长至6000bpDNA片段的转座，因此MLE转座子既可以开发成基因诱变的突变工具，也可以开发成转运基因的转基因工具。（2）MLE转座子在基因组插入位点接近随机，靶向序列为TA，统计结果表明，MLE转座子80%插入位点位于基因5‘端UTR的下游和基因编码序列，这一特点使MLE转座子在应用于基因标签上更优越于其他类型的转座子。（3）异源转座率高，绝大部分MLE转座子转座不依赖于宿主因子，只要有活性转座酶和能被转座酶识别的TIRs存在，就能实现转座，因此从宿主克隆的转座子导入非宿主基因组后，依然能够保持转座活性。因此开发出基于超活性MLE转座子的高效试剂盒，将为大规模构建植物突变体库和研究基因功能提供新的工具，使植物基因的分离和鉴定更加简单易行。查询以往专利，尚未有利用植物MLE转座子构建转座子试剂盒的报道。

发明内容

目前利用转座子标签法成功克隆植物基因目前仅限于Ac/Ds和Spm/dSpm这两类转座子，这两类转座子均存在着转座活性不高，突变效率不理想和优先转座到与之相临近位置的问题，是目前利用转座子构建随机饱和突变体群的主要障碍。因此进一步研究、挖掘新的转座子，改进试剂盒，达到最佳标签条件，是当前转座子标签法研究的主要任务。