[发明专利]一株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8-alkB2

说明书

1技术领域

本发明涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制备、鉴定及其降解能力的测定。

2背景技术

微生物降解是去除环境中石油污染物的主要途径。生物修复是指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环境污染的受控或自发过程，是在微生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术。

土著微生物降解污染物的潜力巨大，但驯化时间长、生长速度慢、代谢活性低，因而转入外源高效污染物降解基因，能够提高生物修复效率。近年来，构建高效的基因工程菌以显著提高污染物的降解效率成为油类污染治理的一个热点，它为解决生物修复周期长等问题提供了崭新的途径。国外学者Charkrabany经过研究发现能降解芳烃、萜烃、多环芳烃的细菌的降解基因位于质粒上，他根据质粒容易传递的特性将能够降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作为受体细胞，分别将能够降解芳烃(含质粒B)、萜烃(含质粒C)、多环芳烃(含质粒D)的质粒，用遗传工程的方法人工转入受体细胞，获得多质粒的“超级细菌”，这一新型菌能同时降解四种石油组分，能把原油中约2／3的烃类消耗。它的突出优点是比自然菌降解速度快。所以，本研究着重选取恰当的基因，构建基因工程菌，以期解决土著菌降解效率低的难题。

烷烃降解菌的降解酶基因以烷烃末端但加氧酶AlkB相关的烷烃羟化酶为目前的研究热点。烷烃进入细菌后，先被细胞膜上的AlkB蛋白进行末端羟基化，然后在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的作用下进一步氧化，最后加上乙酰辅酶A，进入β氧化循环，分解成二氧化碳和水，AlkB酶是烷烃降解的限速酶。

某些微生物能以烷烃为碳源已被公认，但大多数生化和遗传研究主要还是集中在有限的几个原型系统，Alcanivorax borkumensis烷烃羟化酶系统是其中之一，Alcanivorax borkumensis是海洋微生物中一种独特的、以烷烃为主要的特异性底物生长的杆状γ-蛋白菌。该菌遍布全球众多海域，包括太平洋、地中海、日本海、中国沿海和北极。在没有污染的海洋中，该菌数量很少，但在石油污染的开发海域或海岸，该菌可快速生长成为污染水域中的优势菌群，在石油降解菌群中，该菌所占比例为80-90％。近期研究报道证明A.borkumensis在石油污染生物修复中发挥关键作用。2006年，Nature Biotechnology报道了A.borku-mensis SK2的基因组全长序列及其功能分析结果，发现该菌基因组中含有多个编码烃类物质分解代谢酶系统的基因簇，如alkSBlGJH基因簇，gntR和alkB2，p450等。这些基因编码的蛋白在n-烷烃转变成脂肪酸的过程中发挥重要作用，其中alkB2编码的烷烃羟化酶是不含血红素铁的膜蛋白，其催化的烷烃羟化反应是烷烃降解作用过程中的第一步也是关键步骤，其烷烃降解的范围是C8-C16。因此，我们选择A.borku-mensis SK2的alkB2基因为目的基因。

3发明内容

本发明的目的是制备一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌，并鉴定其降解能力。

Y8菌是从定海港口受污染的海水中，采用富集培养微生物的方法，分离获得的对油类污染降解效率较低的土著菌，但能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖。经紫外分光光度法检测，其对柴油污染物的7天降解效率仅为10～15％。

对Y8菌株直接进行菌落PCR扩增，得到16S rDNA的基因序列，构建系统发育树，结果表明Y8菌株与Klebsiella oxytoca strain ATCC13182相似度达到99％，由此可确定该菌株属于克雷伯氏菌，重建的系统发生树表明Y8与Klebsiella oxytoca strain ATCC13182所构的支为姐妹群关系。

提取Y8基因组，经PCR分析得知Y8中未含有烷烃羟化酶AlkB2，由于烷烃羟化酶是柴油降解的重要限速酶，所以采用基因转导的方法，在Y8中转入alkB2基因，构建基因工程菌Y8-alkB2。

经鉴定Y8-alkB2能特异表达AlkB2蛋白，对柴油的降解率分别为：2天，20.14％；4天，51.94％以及6天，72.16％。

4附图说明

图1：根据Y816s rDNA序列构建的系统发育树。

图2：PCR鉴定Y8中alkB2基因表达：P-质粒；G-基因组。

图3：pCom8-alkB2质粒的鉴定(质粒大小、PCR和酶切)

图4：Y8-alkB2菌株抽提质粒PCR、酶切鉴定以及蛋白表达鉴定的鉴定。

图5：Y8与Y8-alkB2菌株对柴油的降解效率比较。