[发明专利]制备特异性沙门氏菌系列诊断血清的工程菌株及构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，涉及能够制备特异性沙门氏菌系列诊断血清的工程菌株，更具体说是一种能够制备特异性沙门氏菌H:z15诊断血清的工程菌株及构建方法。

背景技术

沙门氏菌是一种肠道细菌，是变形菌门(Proteobactera)γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)肠杆菌目(Enterobacteriales)肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的一个属。沙门氏菌是革兰氏阴性菌，杆状，不生产孢子，周生鞭毛，明显可运动，直径0.7~1.5 μm，长2~5 μm。沙门氏菌是化能异养菌，兼性厌氧。

鞭毛是某些细菌表面附着的细长呈波状弯曲的丝状物，由细菌胞浆膜内侧毛基体伸出，穿过细胞壁突出于菌体外，其化学组分主要是蛋白质，只含有少量的多糖或脂类。细菌的鞭毛蛋白具有强的免疫原性，构成了细菌的鞭毛抗原(H antigen)。沙门氏菌的鞭毛蛋白是由fliC或fljB基因所编码的，约1.5 kb。沙门氏菌的H抗原分为第一相和第二相。一相由fliC编码，二相由fljB编码，这两个基因通过变位机制协同表达。一些菌株既具有第一相鞭毛抗原，又具有第二相鞭毛抗原，称为双相菌。有的只含一相鞭毛抗原，称为单相菌。沙门菌的鞭毛具有特异的抗原性，鞭毛抗原的特异性取决于鞭毛蛋白一级结构多肽链上氨基酸的排列顺序和空间构型，故可通过血清学反应对沙门氏菌进行分类鉴定。

血清学方法是利用抗原抗体的特异性反应，可见到明显的凝集现象。沙门氏菌诊断血清就是供凝集试验诊断各型沙门氏菌用。研制沙门氏菌诊断血清一直是生物制品领域的热门课题。传统制备诊断血清的方法包括免疫原及免疫血清的制备，吸收与检定及稳定性试验等相关步骤已经非常成熟。但传统方法耗时长，工作量大。且获得的是多克隆血清，其特异性不高，常发生一些交叉反应。所以研究新的血清制备方法已刻不容缓。本发明利用现代分子生物学技术对传统的血清制备体系进行了改造，和传统方法相比减少了大量的吸收去除工作，更省时，且工作量降低，生产的血清特异性高，交叉少，大大降低了生产血清的成本。

发明内容

本发明的目的是构建能够制备特异性沙门氏菌H:z15诊断血清的工程菌株；

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种能够制备特异性沙门氏菌H:z15诊断血清的工程菌株，其特征在于：它是将含有编码鞭毛抗原z15基因的重组质粒pTrc99a-fljB(e,n,z15)，转入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙门氏菌中得到的能够有效表达鞭毛抗原z15的工程菌株。

更具体地说是将fliC基因用质粒pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因替换，将fljB基因用质粒pKD4上的卡那霉素抗性基因替换，通过抗生素初步筛选出缺失菌株，再经过PCR鉴定及测序鉴定，得到相应的缺失菌株G4831△fliC△fljB，然后再将构建的重组质粒pTrc99a-fljB(e,n,z15)转入其中，筛选得到能够有效表达鞭毛抗原z15的工程菌株。

本发明所述的能够制备特异性沙门氏菌H:z15诊断血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC，缺失后基因大小为1100bp（氯霉素乙酰转移酶基因），其序列为SEQ ID NO：1。

本发明所述的能够制备特异性沙门氏菌H:z15诊断血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831△fliC△fljB，缺失后基因大小仍为1500bp（卡那霉素抗性基因），其序列为SEQ ID NO：2。

本发明进一步公开了能够制备特异性沙门氏菌H:z15诊断血清的工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：

(1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831△fliC△fljB)的构建；

(2)重组质粒pTrc99a-fljB(e,n,z15)的构建；

(3)含有重组质粒pTrc99a-fljB(e,n,z15)的克隆菌株的构建。