[发明专利]豆蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及豆蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。

背景技术

豆蚜Aphis craccivora Koch，别名花生蚜、苜蓿蚜，属半翅目蚜科，是豆科作物的重要害虫，具较强的迁飞和扩散能力。豆蚜危害寄主常群集于嫩茎、幼芽、顶端嫩叶、心叶、花器及荚果处吸取汁液。受害严重时，植株生长不良，叶片卷缩，影响开花结实。豆蚜还能大量排泄“蜜露”，引起植物煤污病，从而影响光合作用，导致植株结荚减少、千粒重下降。豆蚜在田间有多种捕食性天敌（如瓢虫、草蛉、蜘蛛等），天敌的保护和利用是豆蚜防治的重要措施。如何对田间不同种类天敌的控制作用进行合理评估，进而选择出繁殖力高、捕食能力和寻找寄主能力强、控害作用明显的天敌资源，是进行天敌保护合理保护与利用的基础与核心。

Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNA COI技术基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点，为准确评价天敌对猎物的捕食作用开辟了新途径。

发明内容

本发明的目的是提供豆蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。

为了实现本发明目的，本发明根据豆蚜的线粒体DNA序列，设计一对豆蚜特异性SS-COI引物，其包括：

正向引物LFAcF：5'-CAAACAATATTGCTCATAATAAC-3’

反向引物LFAcR：5’-AAAATTAATAATATAGCTGTAATTAGG-3’。

本发明还提供含有引物LFAcF和LFAcR的用于检测豆蚜的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供所述引物LFAcF和LFAcR，以及含有引物LFAcF和LFAcR的试剂盒在检测豆蚜中的应用。

本发明还提供一种豆蚜的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：

1）提取样品DNA；

2）以步骤1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LFAcF和LFAcR进行PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为193bp的DNA扩增条带（SEQ ID No.3），则判定样品为豆蚜。

本发明根据GenBank中公布的豆蚜COI（JX559638）的一段基因序列，设计一对特异性引物，该引物特异性强，只对豆蚜具有扩增能力，而对我国华北棉区内棉田中的主要昆虫无扩增产物。采用本发明提供的方法和引物检测豆蚜，准确性高，可扩增出193bp大小的片段。采用SS-COI PCR技术检测豆蚜，是对RAPD技术、RFLP技术和mtDNACOI检测技术的补充和改进，SS-COI PCR检测技术操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为3.99E+4，DNA浓度检出限为0.413ng/μL。

附图说明

图1为本发明实施例1中豆蚜特异性引物LFAcF/LFAcR的PCR检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-114为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。

图2为本发明实施例2中豆蚜特异性引物LFAcF/LFAcR的DNA浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准5000bp ladder；1-8为模板DNA浓度413.6ng/μL依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。

图3为本发明实施例2中豆蚜特异性引物LFAcF/LFAcR的质粒浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准5000bp ladder；1-11为模板质粒浓度3.99E+11依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。