[发明专利]一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药类免疫化学领域，涉及一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法。

背景技术

过敏是一种常见病，世界卫生组织的数据表明，20-40%的人都曾罹患过敏性疾病。它是由过敏原（或称变应原）诱发，并由结合于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE抗体所介导的变态反应，即所谓的Ⅰ型变态反应。过敏原是一些外源性蛋白质，在进入人体后可以与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上表面的IgE抗体结合，并引起过敏反应。

过敏诊断包括临床病史、皮肤试验和过敏原特异性IgE检测三部分，只有在三者一致的情况下，才能确诊。过敏原特异性IgE抗体检测，又称为体外过敏原检测，其目的是了解血液中针对某一特定过敏原的IgE抗体含量，从而推断患者体内的相关细胞是否可以与该过敏原结合，以便于过敏性疾病的诊断和治疗。

目前广为接受的过敏原特异性IgE抗体检测方法均采用“夹心法”，其检测流程和基本原理为：首先，将过敏原与固相支持物结合；之后，将患者血清样品与固相支持物孵育，样品中的过敏原特异性IgE抗体与固相支持物上的过敏原结合，形成“过敏原-IgE”复合物；然后，与携带有抗IgE抗体的报告分子孵育，形成“过敏原-IgE-报告分子”夹心复合物；最后，通过测量报告分子得到固相支持物上IgE的含量。

根据固相支持物和报告分子的不同，过敏原特异性IgE抗体检测的方法可以分成三类：（1）ImmunoCAP法，由瑞典的Phadia公司开发，使用纤维素衍生物为固相支持物，具有过敏原种类多，结果准确的优点，也是过敏原特异性IgE检测的金标准，不过价格相对昂贵；（2）酶联免疫法或化学发光法，通常采用酶标微孔板为固相支持物，报告分子分别为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，也是最常见的方法；以及（3）免疫印迹法及蛋白质芯片法是将过敏原吸附到膜或玻璃上，通过过敏原在固相支持物上不同的位置来区分不同种的过敏原。方法（1）和（2）可以进行定量或半定量地检测过敏原特异性IgE抗体，但是它们主要的技术缺点是每次反应只能检测一种指标，并且使用血清样品量较大。而方法（3），虽然理论上一次可以检测多个指标，但是免疫化学反应发生在固相-液相之间，重复性差，灵敏度低，结果不稳定，只能进行定性检测，并且使用样品量大。

在体内除了IgE抗体，IgG4抗体也可以特异性地结合过敏原。IgG4抗体在人IgG抗体的四个亚型中含量最低，通常只占IgG抗体总数的6%左右。与其它的IgG亚型相比较，IgG4诱导补体能力和细胞活化性偏低，因此过敏原特异性IgG4抗体具有免疫调节功能，对过敏原特异性IgG4抗体进行检测也具有重要的临床意义。

过敏原的种类繁多，已知的过敏原超过两万种；最常见的过敏原就有六十多种，可以大致分为：（1）食物类过敏原，包括肉蛋奶、粮食和水果等；以及（2）吸入类或接触类过敏原，包括花粉、动物皮毛、昆虫、霉菌孢子等。由于过敏原种类繁多，过敏的确诊比较困难，所以理想的体外过敏原检测应当具有筛查性质，即对十几种或几十种过敏原进行系统性筛查，这样才能有助于疾病的确诊。但是通常的过敏原特异性IgE抗体检测方法，例如ImmunoCAP法、酶联免疫法和化学发光法，每次反应只能获得一个指标；如果要检测多个指标，则需要多个反应来完成，不仅浪费时间与劳动力，同时消耗了大量的样品与试剂，检测成本相对较高。因此，从医疗需求看，体外过敏原检测迫切需要采用多重检测技术，也就是每个检测反应，可以同时检测多个指标，从而降低成本，省力，省时。

液相芯片技术（或称xMAP技术）是由美国Luminex公司开发的一种多功能多重检测技术平台，可以对生物分子进行高通量、多重检测。液相芯片技术中，固相支持物是带有荧光物质编码的羧基化聚苯乙烯微球，根据平台的不同，微球分别有100种（双色编码）或500种（三色编码）。使用时，首先将微球与相关生物分子进行化学偶联获得探针；检测时，将探针与待测物反应。反应产物通过液相芯片仪的检测通道，使用不同波长的激光分别读取微球的编码以及待测样本上的报告分子（藻红蛋白），实现对样品中待测分子的定量分析。同经典的免疫化学方法相比较，液相芯片法有三点优势：（1）使用微米直径的微球，将免疫化学反应体系由传统的液相-固相反应改变为接近生物系统内部环境的液相反应体系，具有反应速度快、重复性好、灵敏度高的优点；（2）多个指标的并行检测，可以同时检测数百个指标；由于常见的过敏原有六十余种，该技术适合于体外过敏原筛查；以及（3）使用样本少，每次反应只需要数十微升的血清。

发明内容