[发明专利]一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNase I活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNase I活性的方法，属于分子生物学中的酶学技术领域。

背景技术

核酸内切酶是一类特殊的酶，其能够水解破坏核酸（包括DNA与RNA）骨架之间的磷酸二酯键。这一类酶在分子生物学领域起着至关重要的作用，包括DNA修复、复制、基因分型以及分子克隆，同时其被广泛应用在基因工程领域来制备重组DNA分子。随着纳米科学与技术的发展，核酸内切酶开始被应用于组装得到一些新型的基于DNA的纳米组装结构，也被用于对DNA纳米组装体的解组装，进而研究纳米材料的一些动态的光学、电学与磁学性质。DNase I 是一种核酸内切酶，其在许多生化过程中起着重要作用，例如，在细胞程序化的死亡过程中，DNase I能够将DNA分子水解为核小体的基本组成单元。此外，大量的研究表明当DNase I活性降低时，会诱导人和动物发生系统性红斑狼疮，也有可能会诱导产生胃癌或结肠癌；而当DNase I活性过高时，有可能会导致乳腺癌的发生。因此，非常有必要开发一种简便、灵敏的用于检测DNase I活性的方法。

传统的检测DNase I活性的方法包括高效液相色谱（HPLC）与酶联免疫吸附试验（ELISA）等。然而，这些方法具有灵敏度不高，检测时间长，需要昂贵的仪器设备等缺点。为了解决这些问题，新型的检测手段包括荧光试验，电化学法与比色法被开发出来。在这些方法中，比色法虽然简单、成本低，但是其检测限较低；荧光检测法虽然方便快捷，但是需要昂贵的荧光素修饰的DNA探针；电化学方法虽然检测限很低，但是需要对电极进行修饰。所以，本发明提出了一种新型的、简便的、灵敏的检测方法，其基于纳米材料的自组装技术构建了具有强手性的金四面体纳米结构，并以此作为检测基底。

通过DNA杂交形成的手性金四面体，其CD信号强度与手性组装体的含量密切相关，通过外加DNase I，水解起连接作用的DNA分子，破坏手性金四面体的空间构型，必然会导致CD信号的降低。DNase I活性越高，金四面体被解离的越多，CD信号降低的越厉害。通过建立CD信号强度与DNase I活性之间的标准曲线，可以检测溶液中DNase I的活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于金四面体手性纳米结构检测DNase I活性的方法。

本发明的技术方案：一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNase I活性的方法，工艺步骤为：

（一）检测探针的制备

（1）15nm粒径金纳米粒子（AuNP₁）合成

采用常规方法柠檬酸三钠还原氯金酸合成15nm粒径金纳米粒子AuNP₁：将反应用的三角瓶用王水浸泡12h，然后用超纯水冲洗3次后，烘干、备用。向其中加入100 mL 0.25 mM的氯金酸水溶液，搅拌加热至沸腾，5min后加入2.5 mL新鲜配制的质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热，30min后，结束反应，移去热源，待溶液冷至室温后，将AuNP₁溶液放入4℃冰箱。

（2）25nm粒径金纳米粒子（AuNP₂）合成

采用常规方法柠檬酸三钠还原氯金酸合成25nm粒径金纳米粒子AuNP₂：方法与制备AuNP₁相同，只是将柠檬酸三钠的用量变为1.5mL，其余条件均不变，即可制备得到AuNP₂溶液。

（3）AuNP₁和DNA1偶联

步骤（1）合成出的AuNP₁和巯基修饰的DNA1进行偶联形成AuNP₁-DNA1复合体：取50mL 2nM的步骤（1）制备的AuNP₁加入20mg二水合双（对-璜酰苯基）苯基膦化二钾盐，震荡混匀，孵育12h后离心去除上清液，将沉淀以10 mL 0.5×TBE重悬；向其中加入DNA1，控制DNA1与AuNP₁的摩尔比为5:1，2h后，加入2M氯化钠使得氯化钠终浓度为50mM。12h后，离心，去除游离的DNA1分子，得到AuNP₁-DNA1复合体。

DNA1：HS-5’-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC-3’。